铁死亡(ferroptosis) 于2012年被Stockwell团队发现，是一种在形态学、生物化学、基因学等方面均不同于细胞凋亡、坏死、焦亡和自噬等传统细胞死亡途径的新型细胞死亡类型。铁死亡的主要特征为铁累积和脂质过氧化, 铁死亡的调控机制涉及铁代谢、谷胱甘肽代谢和脂质过氧化反应等方面, 并与肿瘤、衰老、神经退行性疾病、缺血再灌注损伤、心脑血管疾病、肾脏损伤、肝纤维化等疾病的病理过程密切相关。

细胞的铁死亡可以使用一些常用的细胞死亡检测方法进行研究, 如乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH) 检测法和碘化丙啶(propidium iodide, PI)、SYTOX Green等细胞核荧光染色标记法。

一、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH) 检测法

细胞死亡伴随的细胞膜结构破坏会导致细胞质中的内容物释放到培养液中, 其中包括活性较为稳定的LDH, 因此检测LDH的释放可用于死细胞和受损细胞的定量分析。LDH的相对水平通过其体外酶活力来反映, 即在LDH催化乳酸脱氢的作用下, NAD+被还原生成NADH, 而NADH和四唑盐类化合物被硫辛酰胺脱氢酶催化反应生成NAD+和红色甲臜, 生成的红色甲臜在490 nm下产生吸收峰, 通过比色法可以定量乳酸脱氢酶的活性, 进而测定死细胞和受损细胞的数量。

该方法操作简单, 对仪器设备要求低, 但特异性不高, 不能用于区分不同的细胞死亡方式。因此, 这种方法一般作为铁死亡研究的早期筛选手段。

二、荧光探针法

PI是一种常用于检测细胞死亡的荧光染料, 当细胞膜破损后, 它可以进入细胞嵌入双链DNA, 形成PI-DNA复合物释放出红色荧光(激发和发射波长分别为535和615 nm)。PI常与钙黄绿素乙酰氧基甲酯(Calcein-AM) 等活细胞染料联用, 借助流式细胞仪、荧光显微镜等仪器广泛用于活细胞和死细胞的定量分析。

SYTOX Green是另外一种用于检测细胞死亡的高亲和力核酸染料, 它与PI的作用原理相似, 可轻松穿透细胞膜受损的死亡细胞, 而不会穿透活细胞。死细胞在与SYTOX Green短暂孵育后, 会被激发出亮绿色的荧光(激发和发射波长分别为502和523 nm)。与PI相比, SYTOX Green与核酸结合的能力更强, 操作更为简单(染色后无需清洗), 这也使得其在铁死亡研究中的应用更具优势。

铁死亡涉及复杂的诱导和调控机制, 多种信号通路与代谢途径参与, 因此针对铁死亡的研究方法和策略具有多样性。值得注意的是, 这些荧光探针虽然操作简便, 可用作定量和可视化分析, 但它们存在检测特异性不高的缺点。因此, 在实际应用的时候, 应结合使用铁死亡及其他细胞死亡方式的工具药来帮助鉴定铁死亡的发生。

来源：基因狐