多索茶碱（Doxofylline）主要用于支气管痉挛引起的呼吸困难，作为新一代茶碱药物，其具有疗效高、副作用小等特点；但该药与茶碱一样，同样存在个体差异较大，大剂量给药时可能引起血压下降、心律不齐、阵发性痉挛等不良反应，故临床需密切监测血药浓度。目前，检测血药浓度主要采用高效液相色谱（HPLC）法，但传统的HPLC法存在前处理较复杂、常使用大量有机溶剂、残留蛋白易堵塞色谱柱等问题。本研究对传统方法进行优化和改良，建立了一种简便、快速、准确的检测方法，适用于临床该药的血药浓度检测。
#方法
01
色谱条件
第二维色谱系统为岛津LC-20ATvp四元低压色谱泵，色谱柱为Waters C18（150 mm×4.6 mm，5μm），流动相为甲醇-水（70∶30，V/V），流速为1.0mL/min，中间柱SC2（25 mm×3.5 mm，5 μm）；第一维色谱系统为岛津LC-20ATvp一元低压色谱泵，流动相为甲醇-水（70:30，V/V），不需要色谱柱，主要用于清洗中间柱；FLC-2801全自动二维液相色谱耦合仪检测波长为273nm；柱温为40 ℃。
工作原理如下图：
A.进样：目标经过中间柱分离杂质后进入分析柱进行分析
B.除杂：中间柱在目标物完全离开后转至第二维柱系统进行反向冲洗，洗去残留杂质
C.返回：中间柱洗净后返回第一维柱系统，为下一次进样做准备
在线二维柱切换-HPLC条件设置-时间程序表见表1。
表1 在线二维柱切换-HPLC条件设置-时间程序表
02
溶液的制备
对照品贮备液、对照品溶液使用25％乙醇溶解配制。质控样品溶液、标曲样品溶液使用空白马血清稀释配制（低、中、高质控浓度分别为37.5、12.5、1.5 μg/mL）。
03
血清样品处理
全血样品以3000r/min转速离心5min，精密量取待测血清样品200μL，加入10％高氯酸600μL，涡旋振荡1min后，以14500r/min转速离心8min，取上清液700μL至进样瓶，加入5.0mol/L磷酸铵溶液70μL调节pH至7.0，涡旋振荡15s，进样10μL，以外标法定量分析。
#结果
01
专属性
各空白样品目标峰处无干扰，多索茶碱与杂质分离较好，保留时间为8.794 min。
图2 专属性HPLC
02
线性关系考察
标曲各点索茶碱质量浓度分别为50.0、25.0、12.5、6.25、3.0、1.5、0.5 μg/mL，绘制标曲拟合回归方程为y＝32015x+1669.85（r＝0.9999），线性范围 0.5～50.0 μg/mL。
检测限与定量限考察：以信噪比为3计算检测限，以信噪比为10计算定量限，结果显示检测限为0.01 μg/mL，定量限为0.5 μg/mL。
03
准确度与精密度试验
结果见表2
表2 准确度与精密度试验结果（x的平均值±s，n＝5）
04
提取回收率试验
高、中、低质控样品溶液的提取回收率分别为93.44％、92.25％、91.63％，RSD分别为1.9％、1.1％、1.8％（n＝3），表明本方法的提取回收率较高且稳定。
05
基质效应考察
取6份不同的空白人血清和空白马血清，处理后加入多索茶碱对照品溶液制备成高、低浓度（37.5、1.5 μg/mL）质控样品溶液并测试，计算基质效应，结果见表3
表3 基质效应考察结果（x的平均值±s，n＝6）
06
稳定性考察
高、中、低质控样品，在室温放置0、2、4、8、16、24h及冷冻保存10 d（反复冻融3次）后，按血清样品处理并测试，结果显示，质控样品溶液峰面积的RSD均＜5.00％（n＝6），表明质控样品溶液在室温放置24 h及冷冻10d的稳定性良好。
07
临床样本测定
取3例用药患者的全血样品，处理后进样分析，计算浓度。结果显示，3例用药患者的多索茶碱血药浓度分别为3.23、3.35、3.68μg/mL，RSD分别为2.28％、2.34％、2.14％（n＝5），血药浓度均在本方法检测范围内，且重现性较好。
#讨论
本方法采用高氯酸沉淀蛋白后直接进样，不但避免有机溶剂萃取造成样品的损失，而且不需要用微孔滤膜过滤，简化了样品处理过程，缩短了样本处理时间。此外，本方法提取回收率高，回收率稳定，不需要加入内标，通过外标法就能达到较好的线性关系。与文献方法比较，该方法试验步骤更为简单、检测时间短、方法线性好、干扰少、准确，适用于临床多索茶碱的血药浓度检测。
来源：小马质谱
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