近年来，二代测序技术（NGS）在不同癌种例如肺癌和结直肠癌中逐步应用于临床基因检测。在国内外肺癌/结直肠癌的检测及诊疗指南中，NGS已经列入临床基因检测的推荐方法之一。自2018年7月到目前，陆续有8款适用于非小细胞肺癌和结直肠癌的NGS试剂盒获得NMPA批准。然而不同实验室，测序平台，核酸提取试剂，生信分析方法等的组合，对检测结果的准确性存在不同程度的影响。
本文将分享一项关于NGS检测平台间的一致性和重复性的研究 [1] ，该研究是由美国的 分子 细胞病理学会议组发起的全球Ring Study。研究结果显示，1% AFs的标准玻片，实验室间结果一致率42.18%。本期特邀来自中国医学科学院肿瘤医院病理科的李文斌教授进行点评，为您揭示NGS检测平台间检测能力差异的现状。
李文斌
副研究员、硕士研究生导师
国家癌症中心/中国医学科学院肿瘤医院病理科主任助理
哈佛大学Dana-Farber癌症中心博士后
2019年北京市科技新星
中国抗癌协会肿瘤病理专业青年委员会委员
中国抗癌协会肿瘤病理专委会分子病理协作组秘书
北京癌症防治学会肺癌免疫治疗专委会常委
北京肿瘤病理精准诊断研究会青年委员会常委
北京肿瘤学会病理专业委员会委员
中国研究型医院学会病理专业委员会青年委员
国家自然科学基金青年项目评审专家
首都卫生发展科研专项评审专家
Journal of Cancer Treatment and Research编委
Artificial Intelligence in Cancer编委
《临床与病理杂志》编委、《中华乳腺病杂志》编委
背景
一般来说，在临床应用之前，进行临床NGS检测的实验室，除传统的FFPE样本外，还需验证其细胞学样本的检测能力。尽管来自患者的常规细胞学样本可用于验证基因突变分析，但其
来源受到多种因素的限制。因此，工程细胞系成为一种患者样本的有效替代品。
近年来，利用CRISPR技术，可以在细胞系中引入点突变，插入和缺失，得到各种适用细胞系。分子细胞病理学会议组最近开发了一种创新的cytocentrifuge/cytospin的工程细胞系玻片：制作含有不同等位基因（包含 EGFR ， KRAS ， BRAF 和其他基因）突变频率（低至1%）的细胞系，并将这些细胞系用于制备含有约2×10 6 个细胞的细胞学分子玻片。
这些细胞玻片的验证随后在国际范围内的14个机构中进行，研究结果在2017年5月发表在Cancer Cytopathology [2] ，结果显示，当突变等位基因频率（allele frequencies, AF）比例在10%和5%时，不同平台间重复性很好，而当AFs为1%时，NGS的一致性则很低。
由于在前述研究中，缺乏染色玻片的数据及玻片使用的细胞浓度相对较高，分子细胞病理学会议组认为有必要进一步优化该工程细胞系玻片，以更好模拟实际的临床细胞学样本及常规操作问题。因此，在后续Ring Study中，对工程细胞系玻片进行了优化。
实验设计
这项国际性的Ring Study由那不勒斯·费德里科II大学，德克萨斯大学MD安德森癌症中心和匹兹堡大学医学中心与AccuRef Diagnostics共同发起。
那不勒斯·费德里科II大学和AccuRef Diagnostics设计了一组临床相关突变。主要包括基因缺失 (例如 EGFR c.2235_2249del15 p.E746_A750delELREA) 和一些点突变，包括 EGFR c.2369C> T p.T790M， KRAS c.38G> A p.G13D和 BRAF c.1798_1799GT> AA p.V600K。
AccuRef Diagnostics使用CRISPR / Cas9技术对低分化的结肠癌细胞系（RKO）进行改造，然后将细胞系混合，用cytospin-cytocentrifuge的方法制备不同AFs的4种突变的细胞学玻片。随后，用数字聚合酶链反应(dPCR)确认所有载玻片(A-D)上是否存在改造的突变及突变频率。
AccuRef Diagnostics验证后的未染色的玻片（A-D）随后发放到来自全球范围内的17个实验室。各实验室采用各自的常规操作流程对切片进行染色（Diff Quik，Papanicolaou或苏木精-伊红（HE）染色）。各实验室随后使用其常规用于测试临床样本的NGS平台进行NGS测试。
17家实验室的其中15家在DNA提取前进行了染色，17家平台情况见图1。
图1 17家中心平台情况
结果
17家实验室均提交了结果，在第一轮的结果中：在玻片A和玻片B（10%和5% AFs）中，对于 EGFR 和 KRAS 突变检测，有非常好的实验室间可重复性。而在玻片C（1% AFs）中，17个实验室中有10个未检测到 EGFR 或 KRAS 突变（58.82%）。
由于第一轮的结果中，玻片B和C整体的一致率较低，所以鼓励各中心重新分析结果并目视检查原始数据。在第二轮分析的结果中，有10个在第一轮分析中遗漏的突变被检测到， 而 BRAF c.1798_1799GT> AA p.V600K在突变检出率和AF定量的一致率都较低。（两轮分析的检出率详见表1）
结论
这些数据表明，低丰度突变检测在临床上仍具有挑战性，可能还需要进行目视检查测序reads。cytocentrifuge/cytospin形式的基因组参考标准品对于进行低丰度突变检测的实验室来说，是进行常规质量评估的一个有效的工具。
专家点评
随着肿瘤个体化治疗的不断发展，NGS技术为代表的精准检测方法逐渐从科学研究应用到临床实践中。各个实验室或者检验中心间NGS检测结果的一致性及可重复性就显得极为重要。发表于Cancer Cytopathology（2019年4月）的
来源于全球范围内17家研究中心的数据，对NGS检测平台间性能差异进行研究。从研究中我们发现，为了保证得到一致的NGS检测结果，必须从以下几个方面进行质量控制：
1)样品质控：肿瘤细胞含量会直接影响NGS检测结果，过低的肿瘤细胞含量（一般情况低于10%）会直接影响基因突变丰度（Mutant allele frequency，MAF），其中通过HE染色过程确定肿瘤细胞含量对于检测结果准确性至关重要；
2)平台性能参数：研究中样本量很少，数据尚不能显示哪个平台的准确性更高。NGS检测平台性能参数不一致也将影响检测结果重复性差，这也是研究中17家单位检测结果不一致性的原因；
3）检测限设定：研究中发现，当最低检测限阈值设定较低时检测结果一致性较差。当待测基因的MAF值在10%和5%时，不同平台间重复性较好，当MAF为1%时，检测结果的一致性较低。
研究中我们发现即使研究进行二次评估，仍未得到准确一致的检测结果。所以，亟需病理和实验室专家一起努力，制定NGS检测专家共识并指导临床应用。
参考文献
1. Pisapia P, Malapelle U, Roma G, et al. Consistency and reproducibility of next-generation sequencing in cytopathology: A second worldwide ring trial study on improved cytological molecular reference specimens. Cancer Cytopathol. 2019;127(5):285‐296. doi:10.1002/cncy.22134
2. Malapelle U, Mayo-de-Las-Casas C, Molina-Vila MA, et al. Consistency and reproducibility of next-generation sequencing and other multigene mutational assays: A worldwide ring trial study on quantitative cytological molecular reference specimens. Cancer Cytopathol. 2017;125(8):615‐626. doi:10.1002/cncy.21868
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来源：中国医学论坛报今日肿瘤
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