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本期，我们讲讲m5C RNA甲基化重亚硫酸盐测序测序（RNA-BS）实验怎么做，从技术原理、建库测序流程、信息分析流程等方面详细介绍。

一、m5C RNA甲基化测序（RNA-BS）技术原理

m5C 是 RNA 百余种修饰中研究较多的?种。m5C 存在于 tRNA 上时，可以对翻译进?调节；存在于 rRNA 上时，可以对核糖体的?物合成进?调控；存在于 mRNA 上时，则可以影响 mRNA 的结构、稳定性及翻译过程。

早在 1970 年，就已经在 mRNA 上发现 m5C 修饰的存在，但是由于技术限制，mRNA 上 m5C 修饰的研究多年来进展缓慢。近?年来，多种 m5C 研究?法的出现（如 MeRIP-seq、 miCLIP、Aza-IP、RNA-BS-seq 等）使得 RNA m5C 修饰的研究再次进??们的视野。

其中，RNA-BS-seq 是?种能够从单碱基分辨率?平检测 m5C 的强有?的技术。该技术利?重亚硫酸盐处理 RNA，使RNA 上没有发?修饰的 C 被转化为 U，?发? m5C 修饰的 C 碱基则保持为 C。经过 PCR，U 转变成 T，这样便将 m5C 与C 区分开来。结合?通量测序，就可以从转录组范围检测 m5C 修饰。

RNA甲基化测序原理示意图如下：

该技术的优势包括：（1）检测范围为 mRNA；（2）单碱基分辨率；（3）?准确性。

二、m5C RNA甲基化测序（RNA-BS）建库测序

项?最终数据的质量受到样品检测、建库、测序等每?环节的影响。为从源头保证测序数据准确可靠，易基因承诺在数据的所有实验室?产环节严格把关，确保?质量数据的产出。RNA甲基化(调取)建库测序的流程图如下：

（一）Total RNA样品检测

对RNA样品的检测主要包括3种方法：

（1）琼脂糖凝胶电泳分析RNA降解程度以及是否有污染，检测具有明显的18S或28S主带，且条带清晰；

（2）Qubit 2.0对RNA浓度进行精确定量，总RNA 检测总量不低于75ug；

（3）Agilent 2100精确检测RNA的完整性，RIN值不低于7.5。

（二）?库构建与质检

（1）文库构建：

① mRNA调取：使?Oligo（dT）磁珠，将mRNA从Total RNA??调取出来。

② 重亚硫酸盐处理：将mRNA进?重亚硫酸盐处理，使?EZ RNAMethylationTM kit中的Zymo-SpinTM IC Column柱纯化mRNA。

③ 反转录?链合成：加? N6 Pri mer，65℃，5min，置于冰上；加?First strand buffer、 dNTP、 DTT, RNase Inhibitor,混匀，加?SuperscriptⅡ，混匀后进?反转录?链的合成。

④ 反转录?链合成：加?Second strand buffer，dNTP，RNase H，DNA Pol Ⅰ,混匀后置于Thermomixer中16℃反应后，磁珠纯化，EB洗脱。

⑤ 洗脱液通过末端修复、末端加A、接头连接后，进?PCR扩增反应，扩增产物即为最后的?库。

构建原理图如下：

注：

测序接头：包括P5/P7，index和Rd1/Rd2 SP三个部分（如上图所示）。其中P5/P7是PCR扩增引物及flow cell上引物结合的部分，index提供区分不同?库信息的Rd1/Rd2，SP即read1/read2 sequence primer，是测序引物结合区域，测序过程理论上由Rd1/Rd2 SP向后开始进?。

（2）文库质检：

?库构建完成后，先使?Qubit2.0进?初步定量，稀释?库?1ng/ul，随后使?Agilent 2100对?库的insert size进?检测，insert size符合预期后，使?qPCR?法对?库的有效浓度进?准确定量（?库有效浓度> 2nM），以保证?库质量。

（三）上机测序

库检合格后，把不同?库按照有效浓度及?标下机数据量的需求pooling后在HiSeq平台测序，测序策略为PE150。测序的基本原理是边合成边测序（Sequencing by Synthesis）。在测序的flow cell中加?四种荧光标记的dNTP、DNA聚合酶以及接头引物进?扩增，在每?个测序簇延伸互补链时，每加??个被荧光标记的dNTP就能释放出相对应的荧光，测序仪通过捕获荧光信号，并通过计算机软件将光信号转化为测序峰，从?获得待测?段的序列信息。测序过程如下图所示：

三、m5C RNA甲基化测序（RNA-BS）信息分析流程

四、m5C RNA甲基化测序（RNA-BS）质控分析

（一）测序数据说明

测序?段被?通量测序仪测得的图像数据经CASAVA碱基识别转化为序列数据（reads），?件为fastq 格式，其中主要包含测序?段的序列信息以及其对应的测序质量信息。fastq格式?件中每个read由四?描述信息组成，如下所示：

图：FASTQ格式示例

上述?件中第??以“@”开头，随后为Illumina测序标识符(Squence Identifiers)和描述?字；第??是测序?段的碱基序列；第三?以“+”开头，随后为Illumina测序标识符(也可为空)；第四?是测序?段每个碱基相对应的测序质量值，该?中每个字符对应的ASCII值减去33，即为该碱基的测序质量值。

测序过程本身存在发?机器错误的可能性，测序错误率分布检查可以反映测序数据的质量，序列信息中每个碱基的测序质量值保存在FASTQ?件中。如果测序错误率?e表示，Illumina的碱基质量值?Q 表示，则有：Q =-10log10(e)。Illumina Casava 1.8版本碱基识别与Phred分值之间的简明对应关系?下表：

（二）测序数据质控

原始下机数据包含建库时引进的接头序列以及质量过低的碱基，这些因素会导致后续?对到基因组的reads较少，从?导致得到的信息较少，因此需要进?过滤。过滤内容如下：

• 切除接头(adapter)序列；如果整条 read 的碱基平均质量值低于15则去掉整条 read;从序列的开头和末尾截掉碱基质量值?于3的碱基；去除clean后短于20bp?度的序列。

（三）数据质量评估

经过原始数据过滤、测序错误率检查、GC含量分布检查数据汇总。

(四) ?对质量评估

BS-RNA过程包括三个主要步骤：预处理，?对和注释。

第?步是对参考基因组序列、测序数据和基因注释?件进?预处理：

（1）将参考基因组序列并?转换两次：（A）胞嘧啶被胸腺嘧啶取代，（B）?嘌呤被腺嘌呤取代。这种基因组序列转换只需要在第?次使?参考基因组序列时进?，这意味着它可以重新?于使?相同参考基因组序列的所有后续分析。

（2）T-rich reads 的胞嘧啶被胸腺嘧啶取代，?A-rich reads中的?嘌呤被腺嘌呤取代。

（3）修改GTF格式的基因注释?件以适应转换后的参考基因组序列。每个注释?同时转换两次：“C-T”和“G-A”分别附加到基因注释?件中的染?体标记上。

接下来，BS-RNA调?HISAT2程序，根据修改的注释基因?件构建替代剪接，并将预处理的读数与转换后的参考基因组序列对?。BS-RNA过滤掉mapping到参考基因组序列的两种类型的reads：（1）mapping到多个位置的reads和（2）mapping到错误链的reads（将富含T的readsmapping到将参考序列转换为T或将参考序列转换为T的反向补体，将A丰富的reads ?对到将C转换为T或反向补体将G转换为A的参考序列）。mapping步骤完成后，BS-RNA 将提供原始mapping?件（SAM 格式）、过滤mapping?件（SAM 格式）和mapping报告?件。

?对率定义为对于单个样品，将read与参考基因组?对，?能?对上的read数量除以该样品总read数量，即为该样品read的?对率。?对率计算公式如下：

（五）覆盖率评估

（1）甲基化?平计算

甲基化?平可根据未转化为 T 的 C 与转化为 T 的 C 的 reads 的?例计算得到，即：

Beta-value = C-reads / (C-reads + T-reads) * 100%

其中，Beta-value 即为该胞嘧啶的甲基化?平，C-reads 为覆盖该位点的?持甲基化的reads 数?（测得该位点为 C 的reads），T-reads 为覆盖该位点的不?持甲基化的 reads 数?（测得该位点为 T 的 reads）。 计算原理示意图如下：

（2）C位点数统计

将reads?对到基因组后，?对到不同位点的reads数（测序深度）不同，测序深度过低会导致计算的甲基化率不可信。因此，统计了所有C位点的测序深度。分别统计甲基化数据三种不同类型的C碱基的测序深度。

五、m5C RNA甲基化测序（RNA-BS）差异甲基化位点(DMC)的鉴定及统计

（1）差异甲基化位点（DMC）的鉴定

（2）DMC的注释

鉴定出的DMC包含染?体、起始位置、终?位置等信息。根据DMC的位置信息，结合基因组注释信息中所有基因的位置信息及各个基因元件（5utr, cds, intron, 3utr, ncRNA, tRNA）等位置信息，鉴定DMC与哪些基因的哪些基因元件有重叠，以此来判断DMC修饰哪些基因的哪些基因元件。

（3）DMC修饰基因的统计

根据DMC的注释?件，提取出DMC修饰的基因及其的信息，以更加?便地查看DMC修饰的基因。

（4）DMC在染?体上的分布

根据DMC的位置信息，统计DMC落在哪些染?体上，并?图形展示，以了解DMC在染?体上的分布有偏好性。

（5）DMC在基因元件上的分布

同样地，根据DMC的位置信息，分别统计Hyper DMC及Hypo DMC 落在哪些基因元件上。

（6）DMC修饰基因的功能富集分析

基因本体（ Gene Ontology， GO）是基因功能国际标准分类体系，提供了?套动态更新的标准词汇表来描述?物体中基因和基因产物的属性，可以挖掘出?些?物学相关的途径。 GO分为三个Ontology，分别是：分?功能（MolecularFunction， MF）、细胞组分（ Cellular Component， CC）和?物过程（ Biological Process， BP）。

KEGG（ Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因与基因组百科全书）是基因组破译??的数据库。在给出染?体中?套完整基因的情况下，它可以对蛋?质交互?络在各种细胞活动起的作?做出预测。KEGG Pathway显著性富集分析应?超?何检验，找出与整个基因组背景相?，在差异甲基化修饰的基因中显著富集的Pathway。

将鉴定出的DMC所修饰的基因，利?GO和KEGG数据库进?功能富集分析。

对位于cds区的Hyper-DMC和Hypo-DMC修饰的基因进?功能富集分析：

① 对实验组相对于对照组甲基化?平升?的DMC（All-Hyper DMC）修饰的基因做功能富集分析；

② 对实验组相对于对照组甲基化?平降低的DMC（All-Hypo DMC）修饰的基因做功能富集分析；

富集分析采?Fisher检验，结合BH校正。富集分析结果包括表格和图?两部分，其中，表格为所有富集到的GO/KEGG条?，包括显著和不显著的。

易基因RNA m5C甲基化测序(RNA-BS)技术介绍

易基因提供适用于不同科研需求的m5C甲基化测序技术：

• 常规mRNA m5C甲基化测序（RNA-BS）：
• mRNA分离后首先通过亚硫酸盐处理，非甲基化的C转变为U，m5C修饰的碱基保持不变，结合高通量测序，可以对RNA上的每一个C碱基修饰进行定位与定量。常规mRNA +lncRNAm5C甲基化测序（全转录组RNA-BS）：

易基因科技建立的升级版m5C RNA甲基化测序服务，去除人rRNA后，剩余RNA经重亚硫酸盐处理后，结合高通量NGS策略，可在全转录组范围内单碱基分辨率地检测基因m5C甲基化修饰分布。

技术优势：

• 高深度：超高深度重亚硫酸盐处理，检测准确性极高；高通量：结合高通量NGS，全转录组范围内检测；单碱基：单碱基分辨率，快速检测和分析RNA中的m5C。高准确：精确的检测mRNA等每一个C碱基的的修饰水平。

研究方向：

• 与m6A甲基化类似，m5C甲基化已被证明与肿瘤、神经系统紊乱、代谢性疾病、病毒感染以及个体发育等密切相关。此外，RNA甲基化（m5C）与人类疾病密切相关，其功能涉及调控干细胞应激、细胞毒性应激、mRNA出核和植物细胞发育及基因表达等方面。

以上就是关于甲基化RNAm5C甲基化测序（RNA-BS）实验流程和分析思路的介绍，易基因科技提供全面的RNA甲基化研究整体解决方案，技术详情了解请致电易基因0755-28317900。

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来源：深圳易基因科技