让我们从如何检测LNP-mRNA包封率开始。
为什么我们需要定量检测RNA含量？
确定精确的剂量（accurate dosing）
LNP-RNA制备过程就像是包饺子，RNA是馅，包子皮是LNP，只有知道每个饺子皮包多少克陷，才能知道给病人需要喂几个饺子。在体外试验或者体内治疗时， 精确的剂量是非常重要的，因此，我们必需要知道纳米脂质颗粒内部的RNA含量。
包封效率（encapsulation efficiency）
包封率是LNP-RNA非常关键的指标，表示 包裹在脂质纳米颗粒内部的RNA占全部RNA的比例。如果LNP-RNA生物学活性很低，那原因可能是多方面的，但是如果可以知道纳米脂质颗粒内部包封的RNA含量是正常的，就可以排除制剂包封过程出现问题。通过包封率的检测，不仅可以 摸索LNP配方和包封参数，也能够 监测LNP-RNA稳定性随时间发生的改变。
为什么选择Ribogreen作为RNA浓度检测试剂？
Nanodrop检测RNA含量的缺陷
目前最常用的测量核酸浓度的方法是 基于光吸收值的方法（ absorbance-based method），用Nanodrop检测核酸在260nm处的吸收值（光吸收值和浓度成正比）。 基于光吸收值的检测方法有2个主要的缺陷: 第一，检测信号水平很容易受到样品中夹杂的污染物的干扰，比如样品里含有的杂质核酸，蛋白以及盐。 第二，该方法的检测灵敏度很低（ A260=0.1对应样品中的RNA浓度是4 ug/ml）。
RioGreen检测RNA含量的优势
1998年，Victoria L. Singer在Analytical Biochemistry发表文章RNA Quantitation by Fluorescence-Based Solution Assay:RiboGreen Reagent Characterization，首次使用RiboGreen染料来检测RNA浓度。RiboGreen是一种用于 定量检测溶液中RNA含量的超敏感荧光核酸染料，检测下限可以低至 1 ng/ml，使用96孔板检测时，每孔200 ul样品中可以检测到200 pg RNA。RiboGreen检测的RNA线性浓度范围可以跨越3个数量级，从1 ng/ml到1 ug/ml，并且 不会受到样品中存在的蛋白，盐，洗脱剂，乙醇，琼脂糖等杂质的干扰。此外， RiboGreen也可以同样品中的DNA结合，为了消除RiboGreen结合到DNA上产生的荧光信号，在样品中可以加入DNaseI消除样品中存在的DNA。
Moderna公司利用RiboGreen检测LNP包封率
RiboGreen检测RNA原理
要检测LNP内部包封RNA的含量，没有直接测量的方法，需要把LNP裂解掉，释放内部的RNA，因此检测与RNA结合的染料产生的信号时，要不会受到溶液中存在的LNP组分干扰。正是基于此，选择RiboGreen作为核酸染料来检测RNA浓度。 首先检测LNP-RNA溶液中游离在LNP颗粒外的RNA数量，接着用Triton-100破坏LNP结构，使得RNA释放到外部溶液中，检测出溶液中全部的RNA数量。两者的差值就是被包封在LNP颗粒内部的RNA数量，从而获得包封率。
Riogreen检测LNP包封率流程
不同片段的RNA对RiboGreen检测荧光信号的影响
1998年，Victoria L. Singer发表的文章显示，当RNA片段大小在500bp—9kb范围，RiboGreen测试荧光强度和片段大小无关，但是当RNA片段为100bp时， RiboGreen测试荧光强度会减低28%。
不同片段的RNA对RiboGreen检测荧光信号的影响
游离NTP对于对RiboGreen检测荧光信号的影响
1998年，Victoria L. Singer发表的文章显示，对于1—50 ng/ml低跨度范围标准曲线的RiboGreen检测（using 75 mM RiboGreen reagent），游离NTPs或者dNTPs不会提升荧光信号强度，但是当存在2mM dNTP或者NTPs时，rRNA荧光信号强度会被减弱。对于20 ng/ml— 1.0 ug/ml高跨度范围标准曲线的RiboGreen检测（ using 750 mM RiboGreen reagent），游离NTPs或者dNTPs对于荧光信号强度不会产生影响。
Quant-iT? RiboGreen? RNA Reagent and Kit
我们以油管Up 主 Precision NanoSystems发布的视频RiboGreen Assay Training Webinar为例，整理使用 Invitorgen试剂盒Quant-iT? RiboGreen? RNA Reagent and Kit来检测RNA浓度具体操作步骤 。
首先，来看看，这个试剂盒里有哪些东西？
A组分：1ml RiboGreen RNA染料，注意需要避光保持在4度。
B组分：25ml 20×TE buffer，注意此buffer不含有RNase ，可常温保存。
C组分：RNA标样，浓度是100ug/ml，溶解在TE buffer中，需要放置在-20℃。
Invitorgen试剂盒Quant-iT? RiboGreen? RNA Reagent and Kit
1.制备Buffer
我们需要配制2个buffer溶液。
第1个 Buffer溶液，把20×TE buffer稀释成1×TE buffer。
第2个Buffer溶液，用1× TE buffer 和Triton-100 配制成2% TE-Triton buffer。
制备Buffer
2.添加LNP-mRNA样品到96孔板
这里涉及到 稀释倍数的摸索，需要 让LNP-mRNA样品中测到的RNA浓度落到用RNA标样测定的标准曲线范围内。比如，如果标样RNA设定的最高浓度是1000ng/ml，那么你需要根据LNP-mRNA包封时的RNA浓度，大致预测出需要稀释LNP-mRNA的倍数，可以设定一系列梯度稀释倍数进行摸索，找到合理的稀释倍数。
A:测定LNP-RNA样品中游离RNA时，用 1×TE buffer按照一定比例稀释，添加 100ul稀释后的样品到96孔板中。
B:测定LNP-RNA样品中total mRNA时，需要用 2% TE-Triton buffer按照一定比例稀释，添加 100ul稀释后的样品到96孔板中。
添加LNP-mRNA样品到96孔板
3.制备线性浓度梯度的RNA标样
试剂盒里提供的标品
试剂盒里 RNA标样的浓度是100ug/ml，需要用TE buffer稀释到 工作浓度2 ug/ml，然后再用TE buffer稀释到特定浓度，加入96孔板中，每个孔总体积为200ul， 100ul 是用TE buffer稀释到 特定浓度的RNA标样， 100ul是 RiboGreen染料。用酶标仪测定标样中荧光强度， 激发光在480nm，发射光在520nm。
RiboGreen检测方法RNA标样标准曲线绘制（1ml 标样+1ml RiboGreen）
自己制作标品
当然也可以 采用样品RNA作为标准品，RiboGreen Assay Training Webinar视频里先把一定浓度的 样品RNA稀释到浓度为20 ug/mL， 用nanodrop反复确认。然后用TE buffer把样品RNA从20 ug/mL稀释到10ug/ml，在此基础上，用TE buffer和2% TE-Triton buffer继续稀释为一定浓度梯度的RNA。
采用样品RNA作为标准品，稀释线性浓度梯度
添加RiboGreen染料
把试剂盒中RiboGreen染料稀释200倍，然后等比例加入到已经加有样品的96孔板中，如果样品有100ul，那么加入100ul RiboGreen染料。加完染料以后，需要孵育5min。
96孔板样品和标准品添加位置
酶标仪读板子
打开 酶标仪，设置参数，选择 荧光模式， 激发光485nm，发射光528nm，读数，记录数据。
酶标仪读板子
数据处理
数据处理，根据标样得到的荧光值和浓度梯度， 绘制标准曲线，得到 浓度计算公式。把 样品荧光值代入浓度计算公式，就可以得到 对应的浓度，还需要 乘以稀释倍数，才能计算得到 Total RNA浓度和 游离RNA浓度，最后计算包封mRNA浓度等于Total RNA浓度减去游离RNA浓度。
数据处理
总结
LNP-RNA包封率的测定方法是在RiboGreen测定RNA浓度的方法基础上做出的进一步改进，加入Triton-100进行破乳，释放LNP内部的RNA，从而测出样品溶液中所含有的Total RNA。该方法测定RNA浓度的关键点在于摸索合适的稀释倍数，保证样品RNA浓度能够落在标准曲线范围内。 总体来说，利用RiboGreen测定包封率是一种简单易于操作的方法。
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