用流式测钙离子太简单，有本事就来测钙离子通道和感应器吧

Ca2+信号传导对于T细胞亚群功能的激活和调节至关重要。在T细胞受体结合后，磷脂酶Cγ活化通过IP3受体的开放诱导来自内质网（ER）储存的Ca2 +释放，从而导致质膜中Ca2 +释放活化的Ca2 +通道（CRAC）的活化。就这样，这种被称为store-operated Ca2+ entry（SOCE）的Ca2+流入诱导生理反应（例如T细胞活化和分化）所需的细胞内Ca2+浓度的变化。有多种离子通道、感应器和信号分子参与Ca2+浓度的波动，在这些蛋白质中，stromal interaction molecules（STIM）1和2可感应内质网存储的Ca2+耗竭，而ORAI蛋白（ORAI1及其两种同种型，ORAI2和3）是CRAC通道的成孔亚基。 Ca2+ 浓度波动也受到线粒体摄取Ca2 +的调节，这一过程可调节线粒体ATP合成和能量状态、细胞代谢和存活，主要受电压依赖性阴离子选择性通道（VDAC）蛋白的调节，这些蛋白存在于线粒体外膜中。在所描述的三种VDAC同种型中，VDAC1是主要的Ca2 +通道，并且转录最多。最后，T细胞活化时局部Ca2+变化被钙离子信号分子（Ca2+和钙调蛋白依赖性丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶钙调神经磷酸酶，简称CN）检测到。 CN负责活化T细胞（NFAT）去磷酸化的核因子及其核转位。

据报道，Th1、Th2和Th17亚群对Ca2 +对刺激的反应不同，这是T细胞亚群中Ca2 +离子通道和感应器的各种表达模式的可能结果，但这些通道和感应器在蛋白质水平上仍然很难被检测。为此，Jaracz-Ros A等人在《OMIP-048 MC: Quantification of calcium sensors and channels expression in lymphocyte subsets by mass cytometry.》[1]一文中采用质谱流式，在原代小鼠淋巴细胞的单细胞水平进行了此类分析，值得做细胞功能研究的FLOWER参考。

方案

这里用的都是重金属，如果希望改为常规流式，可考虑相同克隆号，然后搭配成多管检测，还是可行的。

设门分析

首先依然是常规的选择有核细胞、排除粘连、选活细胞、选择CD45+白细胞。在这里，不得不插一句，质谱流式的图形真没常规流式好看^_^

接着，选择CD3+B220-，排除掉B细胞，再通过CD5+CD3+，进一步圈定T细胞：

继续对T细胞进行CD4、CD8分群，这里只分成CD4+T和CD8+T两群，接着再从CD4+T中根据foxP3表达分出Treg和CD4+常规T细胞：

常规CD4+T、Treg、常规CD8+T三群细胞，根据CD44/CD62L，分成CD62L+CD44-初始T、CD62L-CD44+Tem、CD62L+CD44+Tcm三个阶段：

常规CD4+T、Treg、常规CD8+T三群细胞的f Ki-67、CD5、STIM1/2、ORAI1/2/3、VDAC1的表达，黑色、红色、蓝色曲线依次对应初始T、效应记忆T、中央记忆T三个阶段，光看这几个图形，大家可能一下子看不出非常明显的趋势：

改成看下面8只小鼠3次独立实验后的统计结果（Mean±SEM），可见荧光强度之间的显著变化：

可见这些钙离子通道和感应蛋白在T细胞活化过程中基本上均出现明显的增高。

感兴趣的FLOWER可尝试着用常规流式来做做看？

References

[1] 《OMIP-048 MC: Quantification of calcium sensors and channels expression in lymphocyte subsets by mass cytometry.》: https://doi.org/10.1002/cyto.a.23504

本文来自流式中文网(flowcyto.cn)欢迎转发到朋友圈，但谢绝复制粘贴转载如有需要请联系

来源：流式中文网