流式分选小鼠成纤维细胞，要检测的FLOWER也可参考

成纤维细胞是生物体发育和成熟的基本组成部分。虽然它们对我们的生存至关重要，但它们也可能是致病的根源，尤其是纤维化疾病。因此，这些细胞为抗纤维化治疗提供了靶点。要研究抗纤维化治疗，需要从活组织中分离和表征成纤维细胞。绝大多数用于建立原代成纤维细胞培养的方案都需要酶消化后将组织细胞铺板培养，然后让成纤维细胞经过一段时间后从组织中迁移出来并粘附在细胞培养皿上。但这种培养方法存在几个问题：

?离开组织的细胞不一定都是成纤维细胞，因此可能会影响下游分析。 ?与在体内相比，成纤维细胞在培养皿中培养时会出现表型变化。

为了解决这些问题，我们可可以通过流式分选直接从真皮组织中分离活的成纤维细胞，对分选出来的成纤维细胞进一步分析可以提供对这些细胞的生理学、转录组和蛋白质组学特征的深入了解，因为这些细胞与体内的成纤维细胞更接近。

首先看Lin抗体混合物的组成，这种抗体混合物采用阴性设门策略设计，可根据这些标记的缺失来选择成纤维细胞。

接着看实验步骤：

1.处死小鼠。对背侧和/或腹侧真皮进行剃须和脱毛。用 70% 乙醇喷洒并擦拭干净。 2.立即收获真皮以保持细胞活力。在要收获的区域周围做全层手术切口。然后可以用镊子从颅骨部分开始抬起该区域，并沿筋膜平面直切地解剖。可以根据需要使用解剖剪刀。随着皮瓣被提起，第二组镊子也可用于去除可能干扰酶消化的皮下脂肪。手术刀的钝面也可用于在收获后从皮肤下方刮去脂肪。 3.从 20% 的聚维酮碘开始，用三个连续稀释浓度 (1:5) 的聚维酮碘洗涤。 4.用PBS洗涤。 5.将皮肤浸泡在DMEM培养基中（该培养皿需放在冰上），直到准备开始第6步操作。 6.将皮肤样本转移到组织培养皿盖上，用手术刀切碎。 7.使用解剖剪刀进一步分解样品。最后组织应达到均匀的糊状粘稠状。如下图：

8.将样品转移到含有 20 ml 酶解缓冲液的 50 ml 锥形管中。摇动试管以防止组织结块并增加酶消化的表面积。酶解缓冲液为含0.5 mg/mL Liberase DL的DMEM（25 mM HEPES），应在每次实验时新鲜配制。 9.于 37°C 的水浴中振荡孵育 1.5 小时。 10.从水浴摇床上取出样品，用洗涤缓冲液补足 50 ml 以淬灭酶活性。洗涤缓冲液配方如下：DMEM (25 mM HEPES)、10% 胎牛血清 (FBS)、1% 青霉素-链霉素 (P/S)。 11.在 4 °C 下以 300 g 离心 5 分钟。如果离心后沉淀看起来很小或松散，这可能是由于脂肪组织污染了样品。在分离活细胞时，一般建议离心不超过 300 g，但有时候，500 g 离心可以更好地形成团块，却不会显著增加细胞死亡。 12.吸出上清液，留下大约 7.5 ml 培养基。注意在保留上清液之前先去除脂肪层，以减少脂肪细胞污染。 13.用 5 ml 试管重悬沉淀。继续研磨 5-10 次，通过过滤器将细胞悬液过滤到新的 50 ml 锥形管中。用 20–30 ml 洗涤缓冲液冲洗原管，然后过滤，以获得均匀细胞悬浮液。（这一步可以使用我们的魔滤和魔杵，会更方便一些） 14.在 4 °C 下以 300 g 离心5 分钟。 15.如果有未充分解离的团块，可重复步骤 12 和 13，最后将细胞悬浮液通过 40 μm 细胞过滤器进入新的 50 mL 锥形管。再次用 20–30 ml 洗涤缓冲液冲洗试管，过滤。 16.在 4 °C 下以 300 g 离心5 分钟。 17.小心去上清。 18.用500 μl FACS 缓冲液重悬沉淀并转移到 Eppendorf 管中。如果有红细胞，可加入氯化铵红细胞裂解液（配方见流式中文网论坛）；如果悬液中有大量死细胞，可能会导致细胞成团，可以通过在室温下与 DNase 孵育 15 分钟来避免。 19.如果与DNase孵育过，则需在 4 °C 下再次以 300 g 离心细胞悬液 5 分钟，去上清，再次用500 μl FACS 缓冲液中重悬沉淀。 20.设置未染色对照：将 20–50 μl（根据获得的细胞量而定）细胞悬液加入到200 μl FACS 缓冲液中，并置于冰上并轻轻搅拌。如果细胞表达荧光报告分子，请避光。 21.取同样体积的细胞悬液（20~50ul），与Lin抗体混合物（CD31、CD45、Tie2、Ter-119、EpCAM 和 CD324 (E-cadherin)）振荡避光孵育 30 分钟。 22.如果不需要二抗或链霉亲和素 eFluor 450，请跳至步骤 23。但是，这里的方案需要链霉亲和素 eFluor 450，因为 TIE-2 和 CD324 目前只找到生物素偶联抗体，所以样本需要4℃ 300g离心5分钟后，加入500ul FACS缓冲液重悬，然后加入7.5ul链霉亲和素 eFluor 450，温和振荡避光、置冰上孵育20分钟。 23.用 FACS 缓冲液洗涤细胞悬液，并在 4°C 下以 300 g 离心 5 分钟。 24.去上清并再次洗涤。 25.用500 μl FACS 缓冲液中重悬沉淀。通过细胞过滤器过滤细胞，转移到流式管，避免团块使得流式细胞仪堵塞。 26.将死活染料添加到样品中，例如 DAPI等。死活染料可以与Lin抗体混合物相同通道，可以留出其它通道加别的抗体。 27.流式分选仪上机，分出DAPI-/CD31-/CD45-/Tie2-/Ter119-/EpCAM-/CD324-的细胞，即为成纤维细胞，如下图：

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来源：极客地带