如何用流式来检测细胞焦亡pyroptosis？

细胞焦亡引起的细胞死亡关键取决于炎性半胱氨酸蛋白酶对gasdermin的裂解，然后gasdermin N端片段的寡聚化和膜易位。目前，流式无法直接追踪这些事件，检测gasdermin D蛋白（GSDMD）的裂解，是细胞焦亡的唯一确定证据。然而，流式还是可以间接检测细胞焦亡的。

细胞死亡命名委员会将焦亡定义为「一种受调节的细胞死亡形式」，它主要取决于gasdermin蛋白家族成员质膜孔的形成，通常是（但并非总是）由于炎性半胱氨酸蛋白酶激活而引起的。细胞膜破裂和DAMPs释放是焦亡共有的特征，焦亡是对微生物感染的反应，在抵抗细胞内病原体的免疫中起着至关重要的作用。细胞焦亡会破坏受感染的细胞，从而引起细胞内病原体的释放，使其易于被中性粒细胞杀死和吞噬。DAMPs和炎性细胞因子IL-1β和IL-18的同时释放会招募更多的免疫细胞，从而确保固有免疫系统和适应性免疫系统均具有强大的炎症反应。但是，焦亡还可以驱动致病性炎症，如死性败血性休克。焦亡通常在专业吞噬细胞中观察到，但在其他细胞类型中也可能发生。焦亡的诱因包括细菌和病毒及其产物，即LPS和病毒DNA。

步骤示例

下面的示例以胰腺癌细胞为例子，请大家根据自己做的细胞种类，进行条件调节和优化。

1.在含10％v/v FBS、2 mM L-谷氨酰胺、1 mM丙酮酸钠和50μg/mL链霉素和青霉素的1mL RPMI1640培养基中的12孔板中接种1x10E5 BxPC3胰腺腺癌细胞。要分析的每种条件需重复三个孔。 2.让细胞在含有5％v/v CO2的加湿培养箱中在37°C下生长24小时。 3.用100μLDMSO重建Pyroptosis/Caspase-1分析试剂盒中包含的冻干尼日利亚菌素(Nigericin)，配制成5mM储存液。储存液可以避光并最多解冻两次，可以在–20°C下保存1年。 4.在使用前，用无菌超纯水将尼日利亚菌素储存液稀释至工作浓度为500μM。 5.从细胞中去除旧培养基。 6.要启动细胞焦亡，在37°C下将细胞在300μL含有20μM 尼日利亚菌素的新鲜培养基中预孵育1 h（必须确定每种细胞的最佳浓度）。 7.用50μLDMSO重建Pyroptosis/Caspase-1分析试剂盒中包含的冻干FLICA的小瓶，产生150–300x的储存液。储存液可以避光并最多解冻两次，可以在–20°C下保存6个月。 8.用无菌PBS将FLICA储存液以1：5稀释到30–60x工作液中，并立即将工作液添加到每种条件的两个孔中的细胞中，最终浓度为1-2x。 9.避光保存，在37°C下孵育细胞48小时。 10.用超纯水将Pyroptosis/Caspase-1分析试剂盒中包含的10倍细胞洗涤缓冲液稀释至1倍。 11.将培养基和解离下的细胞一起转移到置于冰上的5 mL试管中。 12.向每个孔中加入300μL1x细胞洗涤缓冲液，在37°C下孵育10分钟（这可使未结合的FLICA从细胞弥散出来，被洗涤掉）。去除洗涤缓冲液，然后重复步骤11转移到5 mL试管中。 13.重复第12步。 14.向每个孔中添加300μL Accutase酶，在37°C下孵育10–15分钟，以解离所有剩余的贴壁细胞，并将所有液体（含解离后的细胞）转移到新的5 mL试管中。 15.用300μL 1×细胞洗涤缓冲液洗涤每个孔，将所有液体参照步骤14转移到5 mL试管中。 16.将步骤13和步骤15所得的5 mL离心管在4°C（5 min，400×g）下离心以收集所有细胞。 17.弃去上清液，并用冷的1×细胞洗涤缓冲液 洗涤细胞两次。小心避免细胞丢失。 18.将来自步骤13和15的两个相应试管中的细胞重悬并合并到总共300μL冷的1×细胞洗涤缓冲液中，并置于冰上。 19.对于单色分析或单色补偿对照（caspase-1活性），需在4小时内上机获取（用FLICA处理的第一个孔），或在16小时内通过添加Pyroptosis/Caspase-1检测试剂盒中的固定剂（v/v比为1：5）并将样品保存在4°C避光的地方。对于双色分析（caspase-1活性和膜完整性的丧失），需在用FLICA处理的第二个孔中向细胞中添加2μg/mL PI，并立即上机获取，不能固定。对于单色补偿控制（膜完整性丧失），需在第三个孔（未用FLICA处理）中的细胞，添加2μg/ mL PI并立即进行上机获取。

分析示例

（A）BxPC-3细胞用或未用尼日利亚菌素处理48 h的单参数分析，通过FAM-FLICA染色分析caspase-1活性（在之前的预实验中确定48 h为最佳时间点，可最佳分离FAM-FLICA阳性和FAM-FLICA阴性群体）。

（B）BxPC-3胰腺腺癌细胞的FLICA和PI双参数分析，用或未用尼日利亚菌素刺激48 h诱导焦亡（细胞和刺激因素和图A一样）。对于每个样品（未处理和已处理的细胞）。

不过，流式在焦亡检测中，暂时只能作为间接的筛查手段，还需要通过例如蛋白质印迹法等方法来验证细胞焦亡。

节选自：Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). Eur. J. Immunol. 2019. 49: 1457–1973

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来源：极客地带