ZEN (FAM and HEX)

一为无量 无量为一

小中现大 大中现小

——楞严经

TAO (Cy5)

道者

天地混成

万物皆负阴而抱阳

——老子

ZEN（禅）与TAO（道），这就是IDT埃德特双淬灭荧光探针将荧光背景信号大隐隐于市的奥秘。

随着新冠疫情的常态化，病原微生物的PCR检测已经成为最广泛使用的技术之一，其中被称为三代PCR技术的数字PCR（dPCR）已经在不少相关文献中展示出其高灵敏、高精确、绝对定量、耐受抑制的技术特性。在这类研究中，病原微生物的一些特性会对数字PCR的方法学优化提出特殊需求。IDT埃德特的荧光探针产品可以为研究者提供更快的dPCR方法学优化路径。

dPCR通过将PCR反应体系分割为几万个微反应体系，达到了有限稀释的目的，将核酸分子独立地分割于每个微反应体系内进行PCR反应，最终通过微反应体系PCR后的终点荧光信号来分辨其中是否存在靶基因。正是由于这种终点信号检测的模式，所以dPCR在实验优化中要求阴性微反应体系（无靶基因）与阳性微反应体系（含靶基因）均具有较好的荧光区分度，这一方面需要研究人员选择较为合适的探针浓度与退火温度，另一方面则需要尽量降低反应体系中的背景荧光信号，以提高目标报告荧光信号的信噪比。

而在病原微生物检测中，有两种情况会提高数字PCR中的背景信号：一是环境样本、排泄物样本等复杂样本中的有色物质；二是在使用一步法逆转录数字PCR（RT-dPCR）对RNA病毒进行检测时，反应体系中的DTT、逆转录酶等物质会增加反应体系的光谱复杂水平，从而提高背景信号。在这些情况下，研究人员可以改变实验优化思路，通过降低荧光探针的荧光背景来拉低整体的背景信号，从而保证实验结果的高信噪比。

在Taqman探针中，虽然淬灭基团理论上会吸收荧光报告基团的能力，但是由于报告基团与淬灭基团在探针完整时依然有一定间距，所以即使使用无荧光黑洞淬灭剂（BHQ）类物质作为淬灭基团，依然会有一定荧光背景信号，其淬灭率受限于基团间距。在这个时候我们可以有两种选择：

1. 减短探针设计长度，拉近报告基团与淬灭基团间的距离，并使用IDT埃德特的MGB探针以保证其Tm值不因片段长度缩短而降低。
2. 在无法缩短探针设计长度时，可使用IDT埃德特首创的双淬灭荧光探针（Double-Quenched Probe），在靠近报告基团9bp左右的位置增加一个中间淬灭基团，为FRET作用中提供了一个能量的“中转站”，拉近了能量传递中每个基团间的距离，从而提高了荧光淬灭率降低了背景信号（图1）。

图1. 双淬灭荧光探针示意图。图中蓝色序列片段即为双淬灭荧光探针

目前IDT埃德特的双淬灭荧光探针共有两种中间淬灭基团，分别为ZEN与TAO。ZEN基团用于FAM、HEX等报告基团的中间淬灭；TAO基团用于Cy5, Texas Red-X等报告基团的中间淬灭。可以覆盖市场上主流的dPCR设备检测通道，用以优化dPCR实验并提高检测结果的信噪比，便于研究人员分析数据，进而减少dPCR病原检测的灰区、提高检测精度、避免假阴性。

dPCR检测病原的应用实例

猪水泡病SVA病毒的RT-dPCR检测

在巴西农业部与米纳斯联邦大学合作的一项研究中，研究人员对猪水泡病进行了检测方法学的评估，该疾病在临床上难以与口蹄疫区分，兽医的误诊会造成巨大的养殖业经济损失。他们开发了一套一步法逆转录微滴式数字PCR（RT-ddPCR）检测方法，用于对猪水泡病的致病病原A型塞内卡病毒（SVA）进行检测，新开发的RT-ddPCR对猪血等生物样本的检测性能优于逆转录实时荧光定量PCR（RT-qPCR）[1]。同时，研究人员发现在RT-ddPCR的标准检测方法学建立中，双淬灭荧光探针和温度梯度摸索对于降低背景信号和提高阴阳性微反应体系区分度至关重要（图2）。

图2. 使用RT-ddPCR检测SVA时普通单淬灭探针与双淬灭探针的一维微反应体系荧光扩增图。左图微单淬灭荧光探针，右图为双淬灭荧光探针。纵轴显示SVA靶标荧光信号强度，黑色点簇为阴性微反应体系信号，蓝色点簇为阳性微反应体系信号，可见右图双淬灭探针的阴阳性区分度更好。

猴免疫缺陷病毒的RT-dPCR检测

感染猴免疫缺陷病毒（SIV）的恒河猴是研究潜在治疗策略的重要非人类灵长类动物（NHP）系统，因为它们模拟了人类HIV感染的许多关键免疫状态，包括在接受长期抗逆转录病毒联合治疗（cART）时，其静息记忆CD4+ T细胞中潜伏病毒库的持续存在情况。由于用药状态下恒河猴体内的CD4+病毒库载量很低，且评价其状态必须要精准地进行定量，所以灵敏且可以精确定量的RT-dPCR方法成为研究的最佳选择。

而在美国弗雷德里克国家癌症研究实验室的艾滋病和癌症病毒项目组2020的一项SIV检测方法学研究中，他们比较了普通Taqman单淬灭探针、MGB探针及双淬灭探针对RT-dPCR检测的影响[2]。在样本检测中使用单淬灭探针无法区分阴阳性微反应体系信号时，MGB探针及双淬灭探针则表现出了良好的信号区分效果，达到了更高的信噪比（图3）。这一研究为量化检测低水平的真实SIV目标信号提供了方法学优化策略的参考，并对于短探针及长探针分别给出了两种可靠的探针模式选择。

图3. 三种不同探针的微反应体系二维扩增信号图。纵轴为CCR5靶基因荧光信号，横轴为SIV靶基因荧光信号。其中左图为单淬灭探针原始的实验结果，阴性微反应体系与阳性微反应体系无法有效区分；中图为双淬灭探针的优化实验结果，可见微反应体系分为三簇，左下方信号簇为阴性微反应体系，左上方信号簇为CCR5阳性微反应体系，右下方信号簇为SIV阳性微反应体系，不同信号簇区分清晰，圈中SIV拷贝数为10000拷贝；右图为MGB探针的优化实验结果，可见微反应体系分为三簇，左下方信号簇为阴性微反应体系，左上方信号簇为CCR5阳性微反应体系，右下方信号簇为SIV阳性微反应体系，不同信号簇区分清晰，圈中SIV拷贝数为100拷贝。

IDT埃德特荧光探针产品助力数字PCR实验

IDT埃德特专业为各种PCR平台提供全面的引物探针定制合成服务，探针覆盖目前市场上PCR常用的检测波长范围（表1）且适用于市场上多种dPCR设备（表2）。

表1. IDT探针荧光波长范围表

表2. IDT探针荧光报告基团dPCR设备适配表

IDT埃德特可以提供双淬灭、MGB、锁核酸等多种水解荧光探针，助力研究人员优化dPCR实验，更好地进行病原微生物研究或开发新的病原检测手段。

参考文献：

[1] TF Pinheiro-de-Oliveira, AA Fonseca-Júnior, M F Camargos, et al. Reverse transcriptase droplet digital PCR to identify the emerging vesicular virus Senecavirus A in biological samples[J]. Transboundary and Emerging Diseases, 2019(3).

[2] Long S , Berkemeier B . Development and optimization of a simian immunodeficiency virus (SIV) droplet digital PCR (ddPCR) assay[J]. PLoS ONE, 2020, 15(10):e0240447-.

来源：IDT埃德特