药敏试验是抗菌药理学的重要内容，也是临床用药的重要依据[1]。药敏试验可以保持抗菌药物对流行病原菌的有效性，快速的确定病原菌以及药物敏感结果，帮助临床医生加强耐药监测，减少用药的盲目性，合理使用抗生素有效控制感染，避免耐药菌的产生，提升治愈率并减少不良反应[2]。
药敏试验的方法主要有纸片扩散法、E-test法、琼脂稀释法、肉汤稀释法以及分子生物学方法[3]，前四种都是检测细菌表型的方法，分子生物学方法则是从细菌的基因型入手检测细菌发生耐药的内在原因。
K-B法和E-test法结果受人为因素影响大
纸片扩散法（K-B法）和E-test法试验操作基本都是手工完成，操作过程较复杂，人为因素影响较大。
虽然纸片扩散法价格便宜，但确实一种定性的检测方法，且实验中药敏纸片扩散过程中形成的浓度梯度不稳定，药敏试验假耐药更是受人为因素影响较大，准确性在不足。
E-test法虽是一种定量的检测方法，但同样存在纸片扩散法手工操作的一些弊端，且涂布使用的棉拭子大小、吸水量等存在差异，影响实验可比性。另外由于E-test试条成本高，药物选择种类有限，也限制了其应用[4-5]。
[纸片扩散法]
[E-test 法]
分子生物学法检测范围局限，结果待验证
分子生物学法是从基因水平检测细菌的基因型，常用方法包括聚合酶链反应法（荧光PCR）、DNA测序法、基因芯片法、荧光原位杂交法等。该类方法不依赖细菌的大量繁殖，大大缩短了试验时间。
采用分子生物学法检测细菌耐药性的基础是细菌的基因变异，因此必须建立在细菌耐药机制已很明确的基础上，但实际上目前很多细菌的耐药机制并不明确，因此该方法尚有较多应用局限[5]。
例如幽门螺杆菌rdxA基因的突变失活与甲硝唑耐药密切相关，很多研究显示，rdxA基因治疗前后敏感株和耐药株的序列分析并无显著差别，说明rdxA基因非耐药必需基因，可能存在其他的机制，目前甲硝唑耐药机制尚未明确。
另外，分子生物学方法是检测细菌发生耐药的内在原因，并非检测细菌表型，因此其检测结果与临床实际耐药性有待验证。
[分子生物学法]
琼脂稀释法敏感试验，是将不同剂量的抗菌药物，分别加于融化并冷却至50-55℃的定量琼脂培养基中，混匀，并倾注成平板，即为含有药物浓度递减的培养基。接种幼龄菌于该培养基上，经培养后，抑制细菌生长的最低药物浓度为该菌的最低抑菌浓度[12]。
琼脂稀释法虽是CLSI认可的药敏检测方法之一，但试验操作繁琐复杂耗时，并不是临床微生物的首选方法，目前在日常检验工作中很少采用[4-5]。
微量肉汤稀释法更适合临床开展
肉汤稀释法可分为宏量肉汤稀释法和微量肉汤稀释法，两种方法的基本原理相同[8]，利用CLSI推荐的阳离子校正的M-H培养基，对抗菌药物进行不同浓度的稀释后，再接种待测菌，经适温培养后，然后再读取无抗生素的对照孔，从低浓度到高浓度逐一比较，以肉眼观察无菌生长孔为最低抑菌浓度(MIC) [9] 。
微量肉汤稀释法不仅可以准确测定抗菌药物的MIC，还可一次检测一株菌对多种药物的敏感性，更适合临床微生物检验[6-7]。
为了更方便临床开展，人们也不断改进这种方法，目前有许多厂家生产商品化的微量抗生素敏感试验板，改进后的药敏板减化实验步骤，使操作更简便，更适合临床开展细菌药敏试验[13]。
[微量肉汤稀释法]
综上所述，纸片扩散法仅是定性检测，且受人为因素影响大；
E-test法虽然可以实现定量检测 ，但试纸条价格昂贵，抗菌药物种类有限，影响其应用；
琼脂稀释法虽是CLSI推荐的标准方法，但操作复杂不适合临床使用；
分子生物学法大部分药物耐药机制尚不明确，药物选择范围有限；而微量肉汤稀释法相较于其他方法操作操作简便、成本低、结果更准确，更适合临床使用[10-11]。
微量肉汤稀释法是Hp药敏最实用检测方法
幽门螺杆菌(Hp)感染是一个严重的世界性问题，世界上约有一半以上的人感染Hp，WHO将Hp列为I类致癌因子。
近些年报道显示，我国Hp原发耐药率高，其中甲硝唑为40-70%，克拉霉素为20-50%，左氧氟沙星为20-50%，克拉霉素与甲硝唑双重耐药超过25%。
随着Hp抗菌药物耐药情况日渐明显，《第五次全国幽门螺杆菌感染处理共识报告》、《幽门螺杆菌感染的处理: Maastricht Ⅴ / Florence 共识报告》等多部国内外多部指南共识都强调了在根除Hp之前进行药敏试验的重要性。
由于Hp是一种厌氧菌，对于试验操作过程和环境要求较高，标本处理及接种过程中的环境因素均可造成菌体死亡而导致试验失败。
因此完全手工操作的纸片扩散法和E-test法进行Hp药敏试验并不适合，而分子生物学方法可供选择的药物有限，同时其结果与临床实际耐药性有待验证。
采用微量肉汤稀释法无疑是Hp药敏试验的最佳选择方法，该方法不仅能定量检测，同时受试验人员手工操作影响小，检测方法属于表型检测，与临床实际耐药性更相符。
Hp培养、测定、药敏检测试剂盒
Hp培养、测定、药敏检测试剂盒为临床Hp药敏提供了更便利、更实用的工具。
该试剂盒采用微量肉汤稀释法的原理来检测抗生素的最小抑菌浓度，抗生素MIC折点采用CLSI公布的肠杆菌的取值标准，并结合我国国情及实际应用过程中人们公认的标准，最终确定的符合我国实际情况的MIC折点。
该试剂盒通过低温冷冻干燥工艺将14种不同浓度的抗菌药物固定在微孔板上，简化了操作步骤，同时为医生提供了更广的药物选择范围。Hp培养、测定、药敏检测试剂盒通过标准化的药敏检测实验，实现了Hp感染患者的个体化精准治疗。
参考文献
【1】linical And Laboratory Standards Institute(CLSI)．Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated From Animals；Approved Standard–Fourth Edition[S]．USA：National Committee for Clinical Laboratory Standards，2013．
【2】张筝, 赵俊杰, 李运喜,等. 微量肉汤稀释法药敏试验的误差分析[J]. 中国抗生素杂志, 2016, 41(011):858-864.
【3】李妮, 张小宁, 李欢. 临床常用细菌药敏试验方法[J]. 环球市场信息导报:理论, 2014, 000(041):174-175.
【4】吴华. 微量肉汤稀释法与琼脂稀释法检测Hp耐药性的比较[D]. 河北医科大学, 2011.
【5】吴华, 吴淑慧. 幽门螺杆菌药敏试验方法学研究现状[J]. 中国热带医学, 2012(01):112-113.
【6】张永红. 快速药敏纸片法与微量肉汤稀释法的比较[J]. 青海医药杂志(9):43-44.
【7】焦云. 微量肉汤稀释法检测幽门螺杆菌耐药性研究[D]. 河北医科大学, 209.
【8】凌代文. 乳酸细菌分类鉴定及实验方法[M]. 北京：中国轻 工业出版社，1999：130.
【9】周宁, 张建新, 樊明涛,等. 细菌药物敏感性实验方法研究进展[J]. 食品工业科技, 2012, 33(009):459-464.
【10】Roeio Duque-Jamaica，Azucena，Rau1．A Sequential statistical improvement of the liquid cultivation of Helieobacter pylor [J]． Helicobacter，2010，15：303—312．
【11】 A．Weseler，H．K．Geiss，R．Sailer，eta1．A novel colorimetric broth micro dilution method to determine the minimum inhibitory concentration (MIC)of antibiotics and essential oils against Helieobaeter pylor[J]． Pharmacies，2005，60(7)：498—502
【12】全国临床检验操作规程(第三版)[M]. 东南大学出版社, 2006.
来源：广东阳光生物
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