ECL血清学检测：呼吸道合胞病毒的抗原特异性IgG反应

（电化学发光 ECL）

在自然感染或疫苗接种后，需要对呼吸道合胞病毒（RSV）抗原的体液反应进行灵敏而精确的血清学检测。我们利用四种RSV抗原（F，N，Ga和Gb）建立并评价了一套基于MSD电化学发光（ECL）血清学检测方法。为了评估ECL技术的优点，我们使用一个特征良好的“金标准”小组对59名RSV阳性和30名RSV阴性老年人（年龄≥65岁）的急性和恢复期血清样本进行了ECL血清学分析。四种ECL联合检测结果与金标准诊断符合良好，诊断敏感性达95%，特异性达100%。此外，与市场上可买到的诊断ELISA或微量细胞中和试验（ cell based microneutralization assay）相比，ECL试验的组合提供了更高的诊断灵敏度。总之，这些数据显示了使用基于ECL的血清学检测的优势，并强调了它们作为检测老年人群中最近RSV感染的敏感诊断方法的用途。

单位：阿斯利康 MedImmune

检测最近RSV感染的敏感和特异性分析有助于了解RSV感染的发生率，并有可能从流行病学研究和疫苗临床试验中确定保护的相关性。尽管血清学已被证明是比病毒培养或RT-PCR更为敏感的诊断方法，但现有的血清学检测，如ELISA或细胞微中性化检测，仍有局限性。比色ELISA检测的动态范围较窄，而微量细胞中和试验（ cell based microneutralization assay）的变异性较大，劳动强度较大。基于这些原因，我们评估了Meso Scale Discovery（MSD）的电化学发光（ECL）技术平台，因为它报告的动态范围宽，提高了分析灵敏度，减少了非特定背景信号。

在RSV基因组编码的11个蛋白中，我们选择融合蛋白（F）、核衣壳蛋白（N）和附着蛋白（G）进行ECL技术的分析开发。F和G抗原都能诱导中和抗体，从而对随后的感染提供保护，RSV疫苗经常包括或表达这些抗原。利用F、N和G抗原来测量RSV暴露后的血清抗体水平是有充分记录的。虽然F和N的氨基酸序列在RSV A亚型和B亚型之间高度保守，但G的序列差异很大，为流行株之间的抗原变异提供了主要

来源。为了检测G-特异性抗体，不管感染菌株的亚型是什么，我们将两种RSV亚型（Ga和Gb）的G抗原作为诊断策略的一部分。建立了四种ECL检测方法（F、N、Ga和Gb IgG），并对其分析和诊断性能进行了评价。为了评价四种ECL检测方法的诊断敏感性和特异性，我们收集了89名老年人（65岁）RSV监测研究参与者的急性和恢复期血清样本，组成了一个特征良好的“金标准”小组。我们的结果表明，利用ECL技术进行RSV抗原特异性血清学检测有许多优点，为老年人群中RSV感染的检测提供了一种改进的方法。

四种ECL检测方法的建立与表征

我们开发了四种ECL检测方法（RSV-F、N、Ga和Gb-IgG）来测量自然感染或接种RSV疫苗临床候选者后的抗原特异性IgG反应。用已知RSV微量细胞中和试验（ cell based microneutralization assay）滴度（log2 IC50=9.9）的个体人样本作为检测对照，确定了最佳检测条件，包括包被抗原的量和MSD Sulfo-tag标记抗体的浓度。抗原滴定实验使用三种稀释液（1:25，1:100和1:400）做质控品，在较高的包被浓度中有显著的“钩效应”（图1）。

最佳分析条件是使每个分析的线性范围最大，背景孔中的非特异性信号最小（表1）。

将每个ECL试验的线性范围与FDA 豁免的诊断性F/G ELISA试剂盒进行比较，使用试验对照作为代表性样本（图2）。

与诊断ELISA中使用的比色TMB读数相比，ECL分析中的钌标记检测抗体可以经历多个激发周期，并产生比诊断ELISA更宽的动态范围。Ga-IgG-ECL法线性范围最宽（6496倍），ELISA法诊断范围最窄（47倍）。接下来，用人源化单克隆抗体motavizumab与RSV F上的中和表位结合，将F-IgG-ECL试验的分析灵敏度直接与诊断ELISA进行比较。在F-IgG-ECL试验（39.8-35481.3 pg/ml）中，motavizumab的结合比诊断ELISA（851.1-26，302.7微克/毫升）。在F-IgG-ECL检测中，motavizumab的最低检测浓度约为诊断ELISA的40倍，进一步证实了ECL检测技术的优越性。

使用至少四天不同的实验和两名分析员对每个ECL分析的分析控制性能进行评估。RSV-F、N、Ga和Gb-IgG的变异系数分别为14.4%、12.8%、19.3%和18.5%。结果表明，ECL法测定人血清体液反应准确、适用。

讨论：

为了检测由疫苗或自然感染引起的RSV特异性抗体水平，需要选择合适的RSV抗原以及分析平台。重组表达和纯化的RSV病毒蛋白（F，N，Ga和Gb）是根据它们在自然感染后的免疫原性、与疫苗临床候选株的相关性和亚型间的序列同源性来选择的。由于RSV-F、N、Ga和Gb特异性抗体的水平在个体中变化很大，并且对感染或疫苗的反应也不同，因此我们选择了MSD的ECL检测平台，该平台具有动态范围宽、非特异性背景信号少、检测限低等优点。四种RSV-ECL检测方法（F、N、G a和Gb IgG）的发展突出了ECL技术相对于使用比色读数的商用诊断F/G-ELISA检测方法的优势。当检测对照作为代表性样本时，ECL检测的线性范围是诊断ELISA的23-138倍。在没有真正RSV阴性血清的情况下，将RSV-F特异性中和单克隆抗体（motavizumab）加入PBS中，比较F-IgG-ECL法与诊断ELISA法的分析灵敏度。ECL检测将motavizumab的检出限降低了近40倍。

对婴幼儿和老年人血清RSV-F、N、Ga和Gb特异性IgG抗体水平的调查表明，ECL检测具有广泛的动态范围。在ECL检测中，老年组的平均血清滴度高于婴儿组。这一观察结果并不意外，因为原发性感染后的免疫力是不完全的，随后的感染贯穿一生。婴儿表现出更广泛的血清滴度，可能是由于母体抗体的减少和对原发性或复发性感染的反应。

这四种ECL检测、微量细胞中和检测和F/G-IgG诊断ELISA检测是在一项诊断概念验证研究中进行的，该研究使用了89名老年受试者急性期和恢复期血清样本的特征良好的“金标准”小组。59名受试者有RSV感染记录（即RSV阳性），另外30名受试者没有RSV感染（即RSV阴性）。四种ECL检测的联合结果与金标准诊断（95%敏感性，100%特异性）一致性好，超过了RSV微量细胞中和检测或ELISA诊断的敏感性。F-IgG-ECL法诊断敏感性最高（80%），优于微中性化法（68%）和F/G-ELISA法（78%）。微量细胞中和检测诊断敏感性较低的部分原因可能是该试验测定了中和感染性的功能性抗体，而不是通过ECL试验和诊断ELISA测定的功能性和非功能性抗体。在95%的老年受试者中，至少有一项ECL试验显示RSV抗原特异性抗体水平上升了4倍。值得注意的是，当血清反应阈值降低到血清滴度上升3倍时，诊断特异性仍然很好（100%）。在此阈值下，59名RSV阳性受试者中有58名被确定（98%的敏感性）。与“金标准”小组不完全一致的原因可能是反复的冻融循环或样品的长期储存。由于“金标准”小组中的配对血清样本来自先前通过RT-PCR和ELISA试验分类为RSV阳性或阴性的受试者，因此样本小组为我们的概念验证研究提供了一个强有力的基准。今后的工作可能会扩大ECL血清学检测的诊断能力，方法是对RT-PCR阳性但ELISA阴性的参与者的样本进行分析。先前的一项研究显示，随后感染RSV的受试者血清中F、Ga和Gb的IgG抗体的基线水平低于未感染RSV的年龄匹配对照者；然而，选择用于我们研究的RSV阳性或阴性受试者的急性期血清滴度没有显著差异。对于本研究中使用的样本，住院时采集的急性期血清样本可能无法准确反映基线血清状态，因为在RSV再次感染后，老年人的抗体水平会迅速上升。虽然在婴儿和儿童中观察到了对G抗原的群体和菌株特异性反应，但Ga和Gb分析测定了受RSV A和B感染的老年人血清中的大量交叉反应抗体。这一观察结果可能归因于血清抗体指向G蛋白中心糖基化区内13个氨基酸的延伸，这是普遍存在的。

综上所述，我们已经建立了一套四种敏感和精确的血清学检测方法，使用ECL技术来测量接触RSV抗原后IgG抗体的反应。以前，我们用F-IgG-ECL法检测疫苗反应，用Ga和Gb法检测儿童人群中RSV感染。应用RSV-F、N、Ga和Gb-IgG-ECL检测方法，对老年呼吸道疾病患者急性期和恢复期血清进行RSV感染的诊断。这种血清学方法可为用RT-PCR或病毒培养诊断老年RSV感染提供一种辅助方法。众所周知，与年轻患者相比，成人的病毒释放量较低，时间间隔较短，如果在病毒释放期内未采集样本，则使用RT-PCR或病毒培养诊断RSV感染很困难。尽管血清学检测不能提供实时诊断，但它非常适合流行病学研究或临床试验的既定样本收集计划。RSV-F、N、Ga和Gb ECL检测的性能和临床应用表明，含有这些抗原的多重血清学检测可以通过减少所需样本量和减少时间和人力成本来提高临床样本检测的效率。使用MSD的ECL技术开发和鉴定多重血清学试验的结果将很快报告。