一种用于禽蛋中沙门氏菌检测的增菌培养液

一种用于禽蛋中沙门氏菌检测的增菌培养液

技术领域

本发明涉及一种用于禽蛋中沙门氏菌检测的选择性增菌培养液，更具体地说，本发明涉及一种用于禽蛋中极低数量受亚致死性损伤沙门氏菌检测的选择性增菌培养液，属于选择性富集禽蛋中极低数量受亚致死损伤沙门氏菌的增菌培养液技术领域。

技术背景

沙门氏菌（Salmonella enterica）是一种全球性的人畜共患的食源性致病菌。全球每年有2亿人到13亿人感染非伤寒沙门氏菌，其中估计有300万人死亡。沙门氏菌菌型繁多，全球已经发现2500多个菌型以上，其中鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌对人类健康威胁最大。

我国的禽蛋总产量居世界首位，而且鸡蛋在我国食品消费中占有重要地位。虽然蛋清中含有溶菌酶、卵转铁蛋白和碱性的环境能抑制微生物的生长，但是肠炎沙门氏菌的yafD基因却能帮助克服这些抑菌物质，因此肠炎沙门氏菌是从鸡蛋中分离出的最常见的菌型，因而鸡蛋和蛋制品是肠炎沙门氏菌最普遍的传播媒介。2010年美国由鸡蛋感染肠炎沙门氏菌而引起近2000例的食物中毒。开发准确并具有高灵敏度性的禽蛋中肠炎沙门氏菌的检测方法，有助于控制沙门氏菌在人类食品安全中构成的潜在威胁。

由于食品进行冷藏、加热、冷冻、高盐、干燥等加工，能使食品中微生物受到亚致死性损伤，在这种状态下的微生物将会变得对一些物质敏感。在GB中的食品微生物检测过程中会用到选择性增菌液和选择性培养基，如用于沙门氏菌检测的四硫磺酸钠煌绿增菌液（TTB）、木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂（XLD），这些选择性增菌液和选择性培养基中的胆盐、煌绿等选择性成分不利于亚致死细胞的生长。因此，为了克服选择性增菌液对亚致死沙门氏菌的漏检，GB中规定使用两步增菌的过程，即采用非选择性增菌与选择性增菌。但是，两步增菌过程需48小时，不利于快速检测。

目前国内外的大多数研究一般使用人工接种法制备样品，其中的沙门氏菌往往较多，检出较容易。但在实际生产和产品中，沙门氏菌感染食品时数量往往是很低的，一般认为的极低数量为1～10 cfu/50g（每50g样品中1～10个沙门氏菌)。虽然目前开发了很多快速检测方法，但是食品中的沙门氏菌常常数量极低且受亚致死性损伤，造成了漏检的情况发生，因此增菌步骤是不可缺少的。

目前尚未发现有针对极低数量亚致死损伤的沙门氏菌的一步快速富集增菌培养液的报道，以及在实际食品样品中的应用。

国家知识产权局于2009.10.28公开了一件申请号为200810093449.1，名称为“引起食物中毒沙门氏菌属快检试剂”的发明专利，该专利涉及一种引起食物中毒沙门氏菌属快检试剂，特别是食源性鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、付伤寒甲、乙沙门氏菌的快检试剂及其制备方法。该快检试剂具有快速、准确、灵敏度高等特点，较传统方法更具有应用价值，对指导临床诊断和治疗，防止滥用抗菌药物具有重要意义。本发明是在增菌液中增加了特异性的沙门氏菌属多价及单价血清，使检测确诊过程缩短至2-6小时，增菌时能够利用特异血清的血清凝集反应，鉴定的准确率均在97%以上。检测致病菌时耗时少、灵敏度高，准确性强。

上述专利其特征在于具有如下配方(克/每升蒸馏水)蛋白胨5.0-10.0；乳糖3.5-4.5；磷酸氢二钠4.0-5.0；磷酸二氢钠5.0-6.0；复合生长因子10.0-20.0；亚硒酸氢钠3.5-4.5；无 菌沙门氏菌属多价及单价血清10-20ml；蒸馏水加至1000mL，调pH7.1。

上述专利是一种快速检测试剂，其缺点之一是：只针对健康的沙门氏菌进行增菌，没有特别针对受亚致死性损伤的沙门氏菌的增菌，而生产中遇到的食品中的沙门氏菌常常处于受亚致死性损伤的情况，且沙门氏菌的数量通常极低；缺点二是：没有明确的对非目标菌的抑制作用，不能有效避免非目标造成的假阳性。

国家知识产权局于2008.5.28公开了一件申请号为200710032778.0，名称为“沙门氏菌显色培养基、检测试剂盒及检测方法”的发明专利，该专利涉及的一种沙门氏菌显色培养基、检测试剂盒及检测方法，属于食品微生物安全监测领域。检测试剂盒由加入了0.1～0.5g细菌特异性酶的混合显色底物M-galactoside的显色培养基与增菌液A缓冲蛋白胨水培养基、B四硫磺酸钠煌绿增菌液组成；检测时，对食品样品进行前处理，先后利用增菌液A、B进行增菌培养，最后将二次增菌液接种至显色培养基上培养，若出现光滑、略凸起、直径1～3mm、边缘整齐的品红色菌落，说明样品存在沙门氏菌。所述的显色培养基成本低廉，试剂盒配置简单，检测方法检测灵敏度高，周期短、可操作性强、适用于处理大通量的样本、易于产业化生产，可以广泛推广应用到食品卫生、环境监测等领域。

上述专利其特征在于配方为：蛋白胨20～30g、酵母膏 粉3～7g、氯化钠4～7g、胆盐0.1～0.5g、琼脂12～15g、混合显色底物 M-galactoside 0.05～0.95g、Na2CO3 0.02～0.04g、选择性添加剂0.01～ 0.05g。

上述专利的增菌液缺点是：使用的是国标中的两种增菌液，检测周期长，容易漏检，无法对现实生产中极低数量的受亚致死性损伤的沙门氏菌进行增菌。

发明内容

本发明旨在解决现有技术中用于禽蛋中沙门氏菌检测的选择性增菌液和选择性培养基不利于亚致死性细胞的生长，从而使食品中极低数量的受亚致死性损伤的沙门氏菌出现漏检的情况，同时现有的非选择性和选择性两步法增菌过程需要48小时，耗费大量时间，不利于快速检测。我们旨在提供一种用于禽蛋中极低数量受亚致死性损伤沙门氏菌检测的增菌培养液，在达到具有选择性、不使非目标菌增长的同时，克服禽蛋蛋清对沙门氏菌的抑制作用，具有显著的沙门氏菌增菌效果，避免禽蛋以及禽蛋制品中极低数量受亚致死性损伤沙门氏菌漏检，且能够使极低数量受亚致死性损伤沙门氏菌快速富集，并在一个步骤内快速检出的目的。

为了实现上述发明目的，本发明的具体技术方案如下：

一种用于禽蛋中沙门氏菌检测的增菌培养液，其特征在于：包括以下原料组分组成：

按照1L所述增菌培养液中的含量计：

蛋白胨 7～11g/L

氯化钠 5～8g/L

磷酸氢二钠 7～9g/L

磷酸二氢钾 0.5～1g/L

煌绿 6～8 mg/L

牛胆盐 0.5～1g/L

萘啶酸 10～14mg/L

脱脂牛奶粉 15～40g/L。

本发明在上述基本技术方案的基础上，其原料组分配比更优选的为：

按照1L所述增菌培养液中的含量计：

蛋白胨 10.0g/L

氯化钠 5.0g/L

磷酸氢二钠 9.0g/L

磷酸二氢钾 1.5g/L

煌绿 6.08mg/L

牛胆盐 1.0g/L

萘啶酸 13.88mg/L

脱脂牛奶粉 20g/L。

一种用于禽蛋中沙门氏菌检测的增菌培养液的制备方法，其特征在于：包括以下工艺步骤：

A、基础液配制

将蛋白胨、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、牛胆盐、脱脂牛奶粉加入到蒸馏水中，搅拌均匀，煮沸溶解，再加蒸馏水调节pH值为7.0～7.4，灭菌得到基础液备用；

B、萘啶酸溶液配制

将萘啶酸充分溶解于0.05mol/L的NaOH溶液，溶解后再加入0.05mol/L的NaOH溶液定容得到萘啶酸溶液；

C、煌绿溶液配制

将煌绿充分溶解于蒸馏水中，溶解后再加入蒸馏水定容，灭菌后得到煌绿溶液备用；

D、增菌培养液配制

按照先后顺序将步骤B得到的萘啶酸溶液、步骤C得到的煌绿溶液加入到步骤A得到的基础液中，摇匀得到所述的用于禽蛋中沙门氏菌检测的增菌培养液。

在步骤A中所述的灭菌为在110～121℃下灭菌15～20min。

在步骤C中所述的灭菌为将煌绿溶液存于暗处，自然灭菌至少1天。

一种禽蛋沙门氏菌的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

A、取蛋清、蛋黄、蛋壳分别加入到增菌培养液中；

B、在36～42 ℃下培养18～24h后，将样品增菌培养液涂在木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂板（XLD）和固体培养基（TSAYE）上，计算非目标菌；

C、采用PCR扩增hilA基因，检测样品增菌培养液中的沙门氏菌。

在步骤A中所述的蛋清与增菌培养液的体积比为1:9，蛋黄与增菌培养液的体积比为1:9，蛋壳加入到20～100ml的增菌培养液中。

本发明带来的有益技术效果：

1、本发明为了解决现有技术中用于禽蛋中沙门氏菌检测的选择性增菌液和选择性培养基不利于亚致死性细胞的生长，使得食品中极低数量的受亚致死性损伤的沙门氏菌出现漏检的情况，同时现有的非选择性和选择性两步法增菌过程需要48小时，耗费大量时间，不利于快速检测的问题，提供了一种新的用于禽蛋中沙门氏菌检测的增菌培养液配方。该配方是通过对增菌培养液组分以及配比的优化和改进，其几种组分和配比相互作用，使得该增菌培养液具有选择性，不会使非目标菌增长的同时，克服禽蛋蛋清对沙门氏菌的抑制作用，具有显著的沙门氏菌增菌效果，避免禽蛋以及禽蛋制品中极低数量受亚致死性损伤沙门氏菌漏检，且能够使极低数量受亚致死性损伤沙门氏菌快速富集，并在一个步骤快速检出禽蛋中的极低数量受亚致死性损伤沙门氏菌。与现有技术中的两步增菌，耗费48小时相比，采用本发明的增菌培养液，只需要一步增菌，用时24小时，大大节约了检测时间，提高了效率，在时间缩短的同时，本发明的增菌培养液选择性的不会对非目标菌进行增菌，排除了干扰，提高了检测准确度，进一步的，本发明的增菌培养液能够对禽蛋食品中极低数量（1～10 cfu/50g）的，且受到亚致死性损伤的沙门氏菌进行增菌，避免了常规增菌培养液无法对受到亚致死性损伤的沙门氏菌进行增菌造成的漏检情况，提高了检测质量，保证了食品安全。

2、本发明增菌培养液中由于加入了三种抑制剂，三种抑制剂相互配合能抑制非目标菌在增菌培养液中的生长，煌绿、牛胆盐、萘啶酸能抑制大肠杆菌、变形杆菌以及其他的部分革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌；促进剂脱脂牛奶粉能够克服蛋清的抑制作用，对受到亚致死性损伤的沙门氏菌有提高复活率的帮助；且本发明通过响应曲面优化，确定了促进剂脱脂牛奶粉和三种抑制剂的最适浓度范围，因此，通过加入促进剂脱脂牛奶粉提高亚致死沙门氏菌的复活率和克服蛋清的抑制作用，同时在不影响亚致死沙门氏菌复活的情况下，通过抑制剂来抑制非目标菌的生长，简化国标中的两步增菌步骤，达到对极低数量受亚致死性损伤沙门氏菌的检出目的。另外，同样通过响应曲面优化，在配方中配比范围的基础上，得到组分在增菌培养液中的最佳浓度，使得非目标菌的抑制效果和受亚致死性损伤的沙门氏菌的促进效果达到最佳。

3、本发明的配方采用常规的制备方法，以及常规的检测方法就能达到本发明的发明目的，更优选的，本发明提供了一种增菌培养液的制备方法和采用增菌培养液检测禽蛋中沙门氏菌的方法，该制备方法具有操作简单的优点，该检测方法具有特异性强，检测灵敏度高，检测时间短的优点。

附图说明

本发明的图1为实施例13中PCR扩增hilA基因检测1～15号样品结果；

本发明的图2为实施例13中PCR扩增hilA基因检测16～30号样品结果。

具体实施方式

实施例1

一种用于禽蛋中沙门氏菌检测的增菌培养液，其特征在于：包括以下原料组分组成：

按照1L所述增菌培养液中的含量计：

蛋白胨 7g/L

氯化钠 5g/L

磷酸氢二钠 7g/L

磷酸二氢钾 0.5g/L

煌绿 6 mg/L

牛胆盐 0.5g/L

萘啶酸 10mg/L

脱脂牛奶粉 15g/L。

实施例2

一种用于禽蛋中沙门氏菌检测的增菌培养液，其特征在于：包括以下原料组分组成：

按照1L所述增菌培养液中的含量计：

蛋白胨 11g/L

氯化钠 8g/L

磷酸氢二钠 9g/L

磷酸二氢钾 1g/L

煌绿 8 mg/L

牛胆盐 1g/L

萘啶酸 14mg/L

脱脂牛奶粉 40g/L。

实施例3

一种用于禽蛋中沙门氏菌检测的增菌培养液，其特征在于：包括以下原料组分组成：

按照1L所述增菌培养液中的含量计：

蛋白胨 9g/L

氯化钠 6.5g/L

磷酸氢二钠 8g/L

磷酸二氢钾 0.75g/L

煌绿 7mg/L

牛胆盐 0.75g/L

萘啶酸 12mg/L

脱脂牛奶粉 27.5g/L。

实施例4

一种用于禽蛋中沙门氏菌检测的增菌培养液，其特征在于：包括以下原料组分组成：

按照1L所述增菌培养液中的含量计：

蛋白胨 8g/L

氯化钠 7g/L

磷酸氢二钠 8.5g/L

磷酸二氢钾 0.8g/L

煌绿 6.5mg/L

牛胆盐 0.6g/L

萘啶酸 11.5mg/L

脱脂牛奶粉 33g/L。

实施例5

本发明最佳配比如下：

一种用于禽蛋中沙门氏菌检测的增菌培养液，其特征在于：

按照1L所述增菌培养液中的含量计：

蛋白胨 10.0g/L

氯化钠 5.0g/L

磷酸氢二钠 9.0g/L

磷酸二氢钾 1.5g/L

煌绿 6.08mg/L

牛胆盐 1.0g/L

萘啶酸 13.88mg/L

脱脂牛奶粉 20g/L。

上述配比为通过响应曲面优化，在配方中配比范围的基础上，得到组分在增菌培养液中的最佳浓度，使得非目标菌的抑制效果和受亚致死性损伤的沙门氏菌的促进效果达到最佳。

实验内容：

1.材料与方法

1.1材料

肠炎沙门氏菌（Salmonella enterica serovar Enteritidis CVCC3377），菌株于含有20%甘油的TSBYE中于-40 ℃保存，且使用时，菌株于TSBYE中37 ℃培养24 h，保存于4 ℃以备使用；鸡蛋购买于超市，并于4 ℃保存；缓冲蛋白胨水(BPW)、木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂（XLD）含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤（TSBYE）购自广东环凯微生物科技有限公司；牛胆盐（BS）、萘啶酸（NA）、煌绿（BG）购自Sigma公司；脱脂牛奶粉（SM）购自Oxid公司。

1.2方法

1.2.1基础培养基的形成

BPW是GB中增菌步骤中的第一步使用的增菌缓冲液，其大部分成分为缓冲剂，能有效地克服食品引起剧烈的pH波动，保护受损的细胞和帮助其复活。因此BPW作为本发明的基础培养基，成分为：蛋白胨10.0 g/L、氯化钠5.0 g/L、磷酸氢二钠9.0 g/L、磷酸二氢钾1.5 g/L。

1.2.2单因子试验

为确定添加剂的种类和用量，分别将在4 ℃放置40天的102 CFU/mL的沙门氏菌接种至含有不同添加剂成分的50 mL BPW中，以不含有添加剂成分的BPW作为空白对照。接种后在37 ℃下静置培养24 h后测量光密度OD540，含有SM成分的小组在37 ℃静置培养24 h后，适当稀释，涂平板于XLD上，37 ℃下培养24 h后进行菌落计数，并计算抑制率。该实验重复3次，每小组3个平行，结果见表 1。考虑到促进剂对非目标菌也有促进作用，促进剂SM使用较低浓度20 g/L，而FE对目标菌的促进作用相对于SM较小，且FE价格昂贵，因此促进剂只使用SM。

表 1 ：不同抑制剂及促进剂对目标菌生长的影响

注：抑制率为负数表示促进作用，抑制率为正数表示抑制作用；抑制率=（1-含有抑菌剂的基础培养基的生长量/基础培养基中的生长量）×100.

1.2.3响应曲面分析优化

单因子实验表明，煌绿对亚致死沙门氏菌有较大的抑制作用，而SM对沙门氏菌的生长具有较大的促进作用，为保证亚致死沙门氏菌的快速生长和复活，向培养基加入促进剂SM，并用响应曲面优化胆盐、萘啶酸、煌绿的用量。优化试验在含有促进剂的BPW中进行，按照响应曲面中心组合旋转设计配制各培养基50 mL，分别接种4 ℃放置40天的102 CFU/mL的沙门氏菌。37 ℃静置培养24 h后涂XLD上，37 ℃培养24 h后计数，结果见表 2。结果利用Design Expert 软件进行分析，建立以沙门氏菌生长量为响应值，萘啶酸、胆盐、煌绿为自变量的数学模型：

LogCFU/mL=8.974+0.088BG-0.399BS+0.013NA-0.013BGBS-0.011BG2+0.149BS2+0.0064BG2 BS-0.019BGBS2

对以上模型进行方差分析，此模型的R2=0.9695，证明此模型具有一定的实际指导意义。方差分析结果见表 3。萘啶酸、胆盐、煌绿三种抑制剂的最佳水平分别为：BG 6.08 mg/L、BS 1.00 g/L 、NA 13.88 mg/L，在此水平组合下的沙门氏菌生长量为：8.988 CFU/mL。

表2 ：中心旋转设计及试验结果

表 3 ：方差分析表

实施例6

一种用于禽蛋中沙门氏菌检测的增菌培养液的制备方法，其特征在于：包括以下工艺步骤：

A、基础液配制

将蛋白胨、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、牛胆盐、脱脂牛奶粉加入到蒸馏水中，搅拌均匀，煮沸溶解，再加蒸馏水调节pH值为7.0，灭菌得到基础液备用；

B、萘啶酸溶液配制

将萘啶酸充分溶解于0.05mol/L的NaOH溶液，溶解后再加入0.05mol/L的NaOH溶液定容得到萘啶酸溶液；

C、煌绿溶液配制

将煌绿充分溶解于蒸馏水中，溶解后再加入蒸馏水定容，灭菌后得到煌绿溶液备用；

D、增菌培养液配制

按照先后顺序将步骤B得到的萘啶酸溶液、步骤C得到的煌绿溶液加入到步骤A得到的基础液中，摇匀得到所述的用于禽蛋中沙门氏菌检测的增菌培养液。

在上述基本方案的基础上，优选的：

在步骤A中所述的灭菌为在110℃下灭菌15min。

在步骤C中所述的灭菌为将煌绿溶液存于暗处，自然灭菌至少1天。

实施例7

一种用于禽蛋中沙门氏菌检测的增菌培养液的制备方法，其特征在于：包括以下工艺步骤：

A、基础液配制

将蛋白胨、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、牛胆盐、脱脂牛奶粉加入到蒸馏水中，搅拌均匀，煮沸溶解，再加蒸馏水调节pH值为7.4，灭菌得到基础液备用；

B、萘啶酸溶液配制

将萘啶酸充分溶解于0.05mol/L的NaOH溶液，溶解后再加入0.05mol/L的NaOH溶液定容得到萘啶酸溶液；

C、煌绿溶液配制

将煌绿充分溶解于蒸馏水中，溶解后再加入蒸馏水定容，灭菌后得到煌绿溶液备用；

D、增菌培养液配制

按照先后顺序将步骤B得到的萘啶酸溶液、步骤C得到的煌绿溶液加入到步骤A得到的基础液中，摇匀得到所述的用于禽蛋中沙门氏菌检测的增菌培养液。

在上述基本方案的基础上，优选的：

在步骤A中所述的灭菌为在121℃下灭菌20min。

在步骤C中所述的灭菌为将煌绿溶液存于暗处，自然灭菌至少1天。

实施例8

一种用于禽蛋中沙门氏菌检测的增菌培养液的制备方法，其特征在于：包括以下工艺步骤：

A、基础液配制

将蛋白胨、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、牛胆盐、脱脂牛奶粉加入到蒸馏水中，搅拌均匀，煮沸溶解，再加蒸馏水调节pH值为7.2，灭菌得到基础液备用；

B、萘啶酸溶液配制

将萘啶酸充分溶解于0.05mol/L的NaOH溶液，溶解后再加入0.05mol/L的NaOH溶液定容得到萘啶酸溶液；

C、煌绿溶液配制

将煌绿充分溶解于蒸馏水中，溶解后再加入蒸馏水定容，灭菌后得到煌绿溶液备用；

D、增菌培养液配制

按照先后顺序将步骤B得到的萘啶酸溶液、步骤C得到的煌绿溶液加入到步骤A得到的基础液中，摇匀得到所述的用于禽蛋中沙门氏菌检测的增菌培养液。

在上述基本方案的基础上，优选的：

在步骤A中所述的灭菌为在115℃下灭菌18min。

在步骤C中所述的灭菌为将煌绿溶液存于暗处，自然灭菌至少1天。

实施例9

以配方的最佳配比为例，介绍制备方法，其中溶剂和溶质的用量的比例适用于各种配比：

A、基础液配制

成分：蛋白胨10.0 g、氯化钠5.0 g、磷酸氢二钠9.0 g、磷酸二氢钾 1.5 g、牛胆盐1.0 g、脱脂牛奶粉20.0 g；

配制方法为：将各成分加入500 ml蒸馏水中，搅拌均匀，煮沸溶解，加水至1000 ml，调节pH在7.2 ± 0.2，115 ℃灭菌15 min备用；

B、萘啶酸溶液配制

成分：萘啶酸1g

配制方法：将萘啶酸充分溶解于0.05 mol/L的NaOH溶液，然后加0.05 mol/L的NaOH溶液至100 ml；

C、煌绿溶液的配制

成分：煌绿0.5 g

配制方法：将煌绿充分溶解于少量的蒸馏水中，加蒸馏水至100 ml，然后存于暗处，不少于1d，使其自然灭菌以备使用；

D、增菌培养液制法

成分：萘啶酸溶液1.388 ml、煌绿溶液1.216 ml、基础液 997.396 ml

配制方法：临用前，按上列顺序，以无菌操作依次加入基础液中，每加入一种成分，应摇匀后再加入另外一种成分。

实施例10

一种禽蛋沙门氏菌的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

A、取蛋清、蛋黄、蛋壳分别加入到增菌培养液中；

B、在36℃下培养18h后，将样品增菌培养液涂在木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂板（XLD）和固体培养基（TSAYE）上，计算非目标菌；

C、采用PCR扩增hilA基因，检测样品增菌培养液中的沙门氏菌。

在上述基本方案的基础上，优选的：

在步骤A中所述的蛋清与增菌培养液的体积比为1:9，蛋黄与增菌培养液的体积比为1:9，蛋壳加入到20ml的增菌培养液中。

实施例11

一种禽蛋沙门氏菌的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

A、取蛋清、蛋黄、蛋壳分别加入到增菌培养液中；

B、在42 ℃下培养24h后，将样品增菌培养液涂在木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂板（XLD）和固体培养基（TSAYE）上，计算非目标菌；

C、采用PCR扩增hilA基因，检测样品增菌培养液中的沙门氏菌。

在上述基本方案的基础上，优选的：

在步骤A中所述的蛋清与增菌培养液的体积比为1:9，蛋黄与增菌培养液的体积比为1:9，蛋壳加入到100ml的增菌培养液中。

实施例12

一种禽蛋沙门氏菌的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

A、取蛋清、蛋黄、蛋壳分别加入到增菌培养液中；

B、在39 ℃下培养21h后，将样品增菌培养液涂在木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂板（XLD）和固体培养基（TSAYE）上，计算非目标菌；

C、采用PCR扩增hilA基因，检测样品增菌培养液中的沙门氏菌。

在上述基本方案的基础上，优选的：

在步骤A中所述的蛋清与增菌培养液的体积比为1:9，蛋黄与增菌培养液的体积比为1:9，蛋壳加入到60ml的增菌培养液中。

实施例13

本发明增菌培养液的增菌效果实验：

增菌效果验证试验

1.选择性分析

将五种与鸡蛋相关的常见微生物接种入本发明增菌培养液（简称SEB）中，经过24 h培养后，5种非目标菌未生长，维持在接种量，相反在BPW中非目标菌生长情况较好，最高可达到1×109 CFU/mL。5中非目标菌在BPW和SEB中生长情况具有极显著差异（p < 0.01），结果见表4。

表 4：非目标菌在SEB和BPW中生长情况

2.SEB应用于人工接种样品

接种肠炎沙门氏菌在鸡蛋样品中采用两种接种方法：（1）接种肠炎沙门氏菌在鸡蛋壳表面；（2）鸡蛋壳不做无菌处理的情况下，在鸡蛋表面打一小孔，用接种肠炎沙门氏菌到鸡蛋清里面；每种接种方法5个平行样品，每个鸡蛋接种4个肠炎沙门氏菌后，存放于4 ℃保存30天。检测时，取蛋清、蛋黄各25 mL分别加入到225 mL的SEB中，蛋壳放入50 mL SEB中，37 ℃增菌24 h后，涂在XLD和TSAYE上，37 ℃培养24 h后计算非目标菌的生长量；同时用PCR扩增hilA基因，检测样品增菌液中的沙门氏菌，PCR结果见说明书附图图 1和图2，C为阴性对照；SE为阳性对照； (a) 接种方式为接种到蛋清在4 ℃放30天后再检测，其中1-5检测鸡蛋壳样品，6-10检测鸡蛋黄样品，11-15检测鸡蛋清样品；（b）接种方式为接种在蛋壳上于4 ℃存放30天后检测，其中16-20检测鸡蛋壳样品，21-25检测鸡蛋黄样品，26-30检测鸡蛋清样品。

结果显示：用SEB增菌后，在TSAYE和XLD平板上未见非目标菌，说明SEB能强烈的抑制鸡蛋样品中的非目标菌。PCR检测结果显示：接种在蛋壳表面的5个样品，其中1个样品的蛋壳上检测到沙门氏菌，3个蛋清样品有检测到沙门氏菌；接种沙门氏菌在蛋清里的5个样品，3个样品的蛋壳上能检测到沙门氏菌，4个样品的蛋清能检测到沙门氏菌。因此，在鸡蛋感染少数量的沙门氏菌并在4 ℃保存30天的情况下，用SEB能有在克服鸡蛋清抑制的同时，并且强烈抑制其他非目标菌的情况下，能有效地检测出样品中少数量受亚致死损伤的沙门氏菌。

本研究通过单因素实验和响应面分析试验建立了既能克服鸡蛋清抑制作用，又能选择性富集鸡蛋样品中低数量的亚致死损伤沙门氏菌的增菌培养液SEB。采用平板计数和PCR方法验证了SEB的增菌效果。结果表明：每个鸡蛋中接种4个沙门氏菌，且放置4 ℃ 30天后，SEB强烈抑制大部分的非目标菌的同时，能选择性富集鸡蛋样品中低数量受亚致死损伤的沙门氏菌，37 ℃静置培养24 h后，菌体浓度能达到105以上。因此，SEB不仅简化了GB中的两步增菌步骤，而且在克服鸡蛋清抑制作用和强烈抑制非目标菌的同时，富集鸡蛋样品中低数量且受亚致死损伤的沙门氏菌。SEB可望应用于鸡蛋等食品中沙门氏菌检测前的增菌处理，可以克服漏检和有效提高检测的准确度。

来源：品牌故事会